时间：2022-06-19 11:41:18
摘要： 深海微生物是地球生物系统的重要组成部分，深海微生物由于其在生态、资源、环境等方面的重要性，越来越受到人们的重视。本文对深海微生物研究开发的历史和进展进行概述。
关键词： 深海微生物； 研究； 开发
Research and development of deepsea microbes
ABSTRACT Deepsea microbes are the important components of earth biological system. Deepsea microbes have received more and more intensive attention as their importance in the research and application in ecology， resources， environments， and so on. In this study， the history and main achievements in deepsea microbial research and developments were briefly introduced.
KEY WORDS Deepsea microbes; Research; Development
深海的概念通常指1000米以下的海洋，占到海洋总面积的3/4，而其中深海沉积物覆盖了地球表层的50%以上。深海及深海沉积物中的微生物生存面临高压，低温或高温、黑暗及低营养水平等几个主要极端环境，长期以来一直被认为是一片“荒芜的沙漠”。20世纪中期，深海测量技术发现深海洋底也有高山峻岭，全世界有8万公里长的山脊蜿蜒在各个大洋，大洋中山脊的发现使人们认识到海洋环境与陆地环境的统一性。1977年美国“阿尔文”号深潜器最早在太平洋上的加拉帕戈斯群岛附近2500米的深海热液区发现了完全不依赖于光合作用而独立生存的独立生命体系。位于生命体系金字塔底部的是微生物，能直接利用深海火山口喷出的硫化物、氮化物、甲烷等低分子化合物作为食物和能源，合成各种生物大分子如蛋白质、糖等。位于金字塔上部的是一些大型生物包括长管虫、蠕虫、蛤类、贻贝类，还有蟹类、水母、藤壶等特殊的生物群落。有人将这样五彩缤纷、生机勃勃的海底生物世界称为海底“生命绿洲”。目前已经有几十个深海热液区生物体系被研究，这种依靠地球内源能量支持，在深海黑暗和高温的环境下，通过化合作用生产有机质的“黑暗食物链”的发现使人类对深海环境以及生物圈有了更进一步的了解。在目前已发现的各种极端环境中深海蕴藏着的生物资源极为丰富，其中最主要的是深海微生物，但这些微生物大部分还鲜为人知。深海环境下极端微生物的研究不仅是目前生命科学最前沿的领域之一，也是海底深部生物圈研究和海底流体活动研究重要的组成部分。该项研究将回答生命起源、生物进化、外太空生命探索等生命科学的重大问题并带动包括21世纪地球科学内的其它学科领域的重大发展。2001年美国国家科学基金(NSF)在其题为“Ocean Science at the New Millenium”的科学发展展望报告中，将海底流体活动研究列为海洋科学今后十年最重要、最有可能取得重大突破和科学发现的前沿研究方向之一，生命科学与海底地球物理、地球化学等在上述研究中将占据重要地位。于2003年10月份开始的整合大洋钻探计划(IODP)将深部生物圈和洋底、海底列为该计划中三大科学课题之一。深海深部生物圈的发现是对“生物圈”广泛范围的进一步了解。虽然海底采集沉积柱状样已经有近80年的历史，大规模的系统研究开始于1968年的深海钻探计划。“深海钻探(DSDP，1968～1983)”、“大洋钻探(ODP，1985～2003)”和“综合大洋钻探(IODP，2003～至今)”等深海研究的三部曲，是国际地球科学历时最长、规模最大，也是成绩最为突出的合作研究计划。大洋钻探计划ODP以独特的视角为我们呈现出另外一个生命世界――掩埋在洋底沉积物中和地壳中的生物圈。在数千米深海海底存在着由微小的原核生物组成，数量极大的生物群，有人估计其生物量相当全球地表生物总量的1/10。与热液口“自养”的微生物不同，深部生物圈的原核生物依靠地层里的有机物实行“异养”。深海大洋中生物圈的发现，让人类认识到地球生态系统的真正基础在于原核生物。正是这些原核生物多种多样的新陈代谢过程，产生了多种多样生物地球化学效果，在此基础上建立了地球的生态系统。微生物总是出现在它们能够生存的一切物理、化学、地质环境中，这似乎是一条基本规律。那些在极端环境中生长并通常需要这种极端环境正常生长的微生物被统称为极端微生物。极端环境涵盖了物理极端环境(如温度、辐射、压力、磁场、空间、时间等)、化学极端(如干燥、盐度、酸碱度、重金属浓度、氧化还原电位等)和生物极端(如营养、种群密度、生物链因素等)，海底被认为是上述极端环境中的极端。在深海环境中广泛存在着嗜酸(pH3以下)、嗜碱(pH10以上)、嗜盐(25mol/L以上)、嗜冷(可达0℃以下)、嗜热(120℃以上)、嗜压(500大气压以上)微生物。深海环境下极端生物特征的研究也为生命极限的研究提供了良好的生物材料并对外太空生命探索不断提供新的线索和依据。科学家们设想：既然在如此严酷的极端环境下微生物还能很好地生存，那么在火星上也会有生命存在。深海微生物学的建立应该追溯到上世纪70年代，美国Scripps海洋研究所Yayanos教授设计、改进高压培养罐并于1979年首先分离出深海嗜压菌，1989年Bartlett首先分离出压力调控的外膜蛋白(OmpH)。1990年日本三菱重工和三洋公司开始为日本海洋科学技术中心研制深海微生物高温/高压培养系统，1994年才完成，耗资七亿五千万日元。该系统的建设和深潜、采样系统的建设极大地推动了深海生物圈的研究进步。1995年Kato等分析了一个压力调控基因簇，1999年Nogi等从马里亚纳海沟分离、鉴定出极端嗜压菌Moritella yayanosii［1～3］；2003年日本、美国和意大利相继展开了深海嗜压菌Shewanella violacea DSS12和Photobacterium profundum SS9全基因组测序［4，5］；2005年3月P.profundum SS9全基因组序列及初步分析在Science上发表［6，7］。除了巨大的科学研究价值，深海微生物研究还具有极大的经济、社会价值而引起广泛的关注。深海生物处于独特的物理、化学和生态环境中，在高静水压、剧变的温度梯度、极微弱的光照条件和高浓度的有毒物质包围下，它们形成了极为特殊的生物结构、代谢机制系统。由于这种极端的环境，深海生物体内的各种活性物质，特别是酶，具有高度的温度耐受性，高度的耐酸碱性、耐盐性及很强的抗毒能力。这些特殊的生物活性物质是深海生物资源中最具应用价值的部分。除了发展、改进海洋微生物的分离培养方法获得新的海洋微生物，筛选活性物质外，应用基因组学研究方法，构建海洋微生物基因组文库，通过研究，操作海洋微生物遗传基因，来获得新的海洋微生物活性物质，这是探索海洋特别是深海微生物资源，研究开发海洋新药物的必然而有效的选择，也是目前深海微生物资源开发的热点。概括来说，深海生物在以下几个方面具有潜在的应用价值：
1 工业应用
工业生产常常要求一些特殊的反应温度、酸碱度并加入一些有机溶剂，在这种条件下，普通酶无法保持活性，因此，依赖酶的工业必须花费大量资金采取特殊的工艺以保持这些酶的活性，从而大大提高了成本，而极端酶在普通酶失活的条件下仍然能保持较高的活性，所以在工业上有着广泛的的应用前景。目前已经有高温聚合酶、糖酶、淀粉酶、蛋白酶等几种极端酶开始工业化生产，并且已经创造了数十亿美元的经济效益。
2 医药应用
从生物体内研制药物治疗人类的各种疾病由来已久。由于越来越多的病原菌或病毒对目前的药物产生了抗药性，并且不断产生新的疾病。因此从海洋中筛选新的生物药物成为海洋药物研究开发的方向。深海生物由于环境的独特性而成为新型特效药物、抗肿瘤、抗病毒、降压降脂等药物的来源。目前国际上在深海药物的筛选方面还未见太多报道，但是可以预料它的前景将是十分广阔的。
3 环境保护
在海底，由于动物尸体聚集、火山喷发等原因造成有毒物质及硫化物等对陆地生物有害物质的浓度较高，而生存在这里的微生物能分解这些物质并以其为能源繁衍生息，因此，这些生物在清除地球表面的重金属、石油等污染物方面具有重要的应用价值。目前日本科学家已经从深海中筛选到具有较高的石油分解能力的菌株，并已开展了应用研究。从20世纪后期开始，随着深海技术能力的提高，越来越多的国家投身于深海研究的前沿领域。目前的深海载人潜器下潜深度达到6500m，无人缆控潜器ROV则可达到11000m水深，并获得最深处马里亚纳海沟深海沉积物样本，研究发现其微生物含量达到103～104/g的水平。实验室深海环境模拟也取得突破进展，已分离鉴定出嗜压、嗜碱、嗜酸、嗜盐、嗜冷、嗜热等极端微生物。目前国际上进行深海微生物研究的国家主要分布在欧洲，美洲及亚洲，其中美国、日本、德国和法国都是深海微生物研究的主力军。目前，在深海微生物的分离培养、多样性调查、功能基因研究和适应性机制研究(如深海嗜压菌的嗜压机制)等方面取得了一定的进展；各类极端微生物在工业用酶、工具酶、环境修复以及生物活性物质等方面的开发应用也有了突破，使人们看到了深海微生物开发的巨大潜力和广阔的应用前景。深海生物资源尤其是微生物资源越来越得到人类的重视。随着科学的发展进步，水下工程技术和探测技术的改进和完善，人类对深海微生物的研究和开发有了更大的空间和可能性。我国深海生物基因的系统研究起步时间较晚，从本世纪初开始主要得到了国家科技部和中国大洋专项的资助。中国大洋协会依托国家海洋局第三海洋研究所成立了中国大洋生物基因研究开发基地，研制、配备了一批船载和实验室深海微生物培养专用设备。在深海设备的支持下，真正意义的深海微生物研究得以开展。到目前为止，基础研究主要开展了深海微生物在物质循环中的作用；极端微生物分离、培养；微生物遗传、代谢研究，深海极端环境下微生物适应性机理的研究等。成功分离、鉴定出各类深海嗜压、嗜热、嗜冷、嗜盐、嗜碱、嗜酸微生物，从中发现了多个未经报道的新种。以此为基础，正在建设国内第一个深海微生物菌株资源库。克隆了多种深海极端酶基因，进行了基因表达和分析。深海微生物抗菌、抗肿瘤活性物质筛选工作也已经开展。深海耐压菌Shewanella comra WP3已基本完成全基因组序列测定，正在开展后基因组研究。开展了深海沉积物宏基因组文库的构建，成功构建了一个深海5000米水深沉积物的cosmid基因文库，通过对克隆子的分析发现文库中微生物来源主要是一些不可培养的微生物新种，部分克隆子序列测定发现克隆子上大部分基因是新基因。目前已筛选到多个能表达生物活性物质的克隆子，正在进行序列测定。总之，深海生物研究是一个依赖于工程技术的高投入项目，我国深海生物基因资源开发利用研究的快速发展还需要更多资金和人才的不断投入。
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关键词：病原微生物 分子生物 诊断技术
【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1008-1879(2012)02-0027-01
1 自动化鉴定技术的应用
临床微生物的实验室检查以染色、培养、生化鉴定等为主，尤其是分离培养，目前仍然是许多病原体检测的“金标准”。但是，由于细菌的生长繁殖需要一定时间，使检测周期难以缩短。此外，很多病原体的培养受营养要求、抗生素应用及病原体含量等因素的影响，用传统人工方法操作复杂、检测周期长，敏感性与特异性也有限。为解决这一问题，各种自动化培养和鉴定系统不断产生，随着计算机的发展和应用，先后出现了许多自动与半自动细菌鉴定与药敏系统，统称为“微生物鉴定专家系统”，这些系统大大提高了临床实验室的工作效率和检测的准确性，传统鉴定方法也在逐步改进，并在一定程度内加快了检测速度。
2 免疫学方法
免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应，检测病原微生物，简化了病原微生物的鉴定步骤，备受关注。各大文献数据库提供的数据显示，几乎建立了所有病原体的血清学检测方法，表明该方法已成为一种微生物实验室常用的成熟的检测技术。
2.1 凝集技术常用的凝集技术有乳胶凝集技术和血清凝集技术。用于微生物的初步诊断、分型、鉴定，例如霍乱弧菌和志贺菌的分型，大肠杆菌O157：H7、脑膜炎球菌等，短时间内就可完成鉴定。该诊断法具有操作简便、快速、准确、特异性强、阳性率高等特点。
2.2 荧光抗体技术荧光抗体技术是根据抗原抗体反应具有高度的特异性，把荧光素作为抗原标记物，在荧光显微镜下检查呈现荧光的特异性抗原抗体复合物及其存在部位。荧光抗体技术的主要特点是特异性强、速度快。吕治林等报道由美国同行所作的用炭疽杆菌细胞壁(CW-DFA)和荚膜抗原(CAP-DFA)特异的荧光标记的单克隆抗体，可快速鉴别炭疽杆菌。
2.3 酶免疫技术酶联免疫技术现已被广泛地应用于多种病原微生物的检测，可检测样本中病原体抗原，也可检测机体中的抗体成分。应用单克隆抗体结合硝酸纤维膜上的斑点ELISA技术，已成功地自患者的咽拭标本中同时检出可能存在的肺炎支原体、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒。Gehring等用酶联免疫化学发光法(ELIMCL)测定大肠杆菌O157：H7。许多疾病的检测都已有商品化的试剂盒出现。
3 分子生物学技术
随着分子生物学技术的迅速发展，使人们对微生物的认识从外部表型逐渐转向内部基因结构特征，微生物的检测也从生化、免疫方法转向基因水平检测，对于那些难培养和不可能培养的微生物，可直接通过获得基因信息，给微生物学的检测带来崭新的领域，为科学快速发展提供了新的机遇。
3.1 PCR技术PCR具有高度敏感性和特异性，在病原体检测上，对形态和生化反应不典型的微生物鉴定，常规方法常难以准确检测，即使出现大量死菌PCR也能做出准确的鉴定；不受混合标本的影响，可轻易从含有大量正常菌群的标本中鉴定病原菌；对于生长缓慢或难于培养的微生物鉴定，如分枝杆菌、幽门螺杆菌、支原体、衣原体、螺旋体等，目前其他方法阳性检出率很低，PCR技术对这类菌株的鉴定有重要意义。但是常规PCR技术也存在一些问题，如出现假阳性、形成引物二聚体，检测操作也比较繁琐，中间污染环节多，易出现假阳性或假阴性结果。为了克服这些不足，一些新的PCR技术渐衍生出来并被用于实践，如巢式PCR、逆转录PCR、多重PCR、通用引物PCR(UP-PCR)、PCR单链构象多态性分析、随机引物DNA多态性扩增(RAPD)、限制性长度多态性分析(RFLP)、实时荧光定量PCR等。
3.2 基于16S rRNA与GyaB的检测技术。
3.2.1 以16S rRNA为靶基因进行检测16S rRNA存在于所有原核生物细胞中，它们相对稳定且有较高的拷贝数，其序列中含可变区及高度保守区，因此可设计群、属、种特异性的探针。现阶段各种常见细菌的16S rRNA基因几乎全部测序完成，16SrRNA编码基因的这些特点使之成为较理想的细菌基因分类的靶序列，逐渐成为细菌鉴定、分类的“金标准”。
3.2.2 以促旋酶(gyrase)B亚单位基因靶基因进行检测GyaB除了具有16S rRNA所具有的优点外，其基因进化率高于核糖体基因，还有GyaB在近乎全部细菌中呈单拷贝形式。有研究表明，基于GyaB序列构建的进化图谱与基于DNA-DNA杂交的相一致。因此，GyaB的分析特别适合于菌株的区别和鉴定。Fukushima等以GyaB基因为靶基因设计基因芯片来检测分枝杆菌属，实验结果显示此芯片鉴别分枝杆菌达到种水平，并且能区别密切相关的菌种，这对临床治疗具有重要的参考价值，说明分析GyaB基因序列对于在菌种水平鉴别细菌是快速而有效的方法。
3.3 多位点序列分型多位点序列分型(MLST)是近年来发展很快的分子生物学分析方法，具有很高的分辨能力，既适于分子流行病学研究，也可用于分子进化学的研究。MLST越来越多地被作为能进行国际间菌株比较的常用工具，建立一种更为准确的分析系统方法，并且用于研究出现的不同的抗生素抵抗株，相关特殊基因型及新的变异株引起的疾病流行病学分析和种群结构的研究。
参考文献
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现代信息技术环境下，微课作为一种重要的微文化逐步进入我们的课堂。本文在微课理论和时代背景下对微生物检验检测微课程教学的可能性进行初步的实践研究，期望能为中职学校今后对该门课程的教学和学习提供参考。
【关键词】
微课；现代信息技术；微生物检验检测
21世纪是以信息化为特征的时代，个性化学习、碎片化学习已成为信息时代教育发展的重要特征。在信息时代的大环境之下，现代信息技术融入教育已经是主流，移动网络、智能手机和平板电脑的迅速发展与普及，微博、微信、微电影等微文化正悄悄地进入了我们的生活，这直接引发了学习方式和课程形式的变迁，微课就这样顺应时代而产生。
1.微课产生的理论基础和时代背景
微课由美国科罗拉多州林地公园高中两位化学教师发明。这所学校地处山区，交通不便，经常出现学生缺课，为了解决这个问题，他们尝试把教学内容录制成视频，配上PPT和讲解，专门发给缺课的学生用于补课。慢慢地，这两位教师又有意识地让所有学生提前在家看视频听讲解，自主学习，第二天在课堂上开展讨论、练习，学会应用，这种教学模式受到越来越多学生的欢迎，由于和传统的课堂学习正好相反，所以人们称之为翻转课堂。2008年，美国新墨西哥州圣胡安学院的高级教学设计师戴维•彭罗斯从理论和模式的角度，提出了“微课程”，并首创了声名远播的“一分钟的微视频”，这为翻转课堂的发展奠定了基础。但这种教学模式直到2011年才开始在全球大热，引起全球教育界的对微课的关注与争论，这要归功于毕业于哈佛大学的孟加拉裔美国人萨尔曼•可汗，他创办了“可汗学院”，将放在YouTube的视频同步在自己的网站上，利用网络影片进行免费授课。目前，微课、慕课、翻转课堂等在国内外受到了广泛的重视。国内率先提出“微课”应用研究的是广东省佛山市教育信息中心的胡铁生，他认为，“微课是以微型教学视频为主要载体，针对某个学科知识点或教学环节而设计开发的一种情景化、支持多种学习方式的新型在线网络视频课程”。教育部高校教师网络培训中心这样定义“微课”：是指以视频为主要载体记录教师围绕某个知识点或教学环节开展的简短、完整的教学活动。认知负荷理论认为，影响认知负荷的主要因素有个体的专长水平（即先前知识经验）、学习材料的复杂性及学习材料的组织呈现方式。教学内容简单、组织形式单一的课堂，认知负荷过低，造成教学时间浪费；教学单元知识点繁多的课堂，认知负荷过高，阻碍学习者的知识建构活动，也容易造成学生注意力涣散。教学的理想模式是学习者可以根据自身实际情况，灵活自主地对重难点、要点、技能点等知识进行满负荷学习，而短小精悍的微课恰好满足了教学理想模式的要求。
2.《微生物检验检测》微课教学的实践研究
2.1《微生物检验检测》课程分析
微生物检测是食品安全控制链中重要的监控点，在食品企业中有专门设立的微生物检验岗位。该课程是一门知识点多、技能性强的课程，传统教学中，一般先是教师讲解、操作演示，再让学生模仿操作练习[11]。这就带来两方面的问题，一方面，教师在讲解演示的时候，学生识记式地在大脑里过一遍，等自己动手操作时就会出现茫然不知所措、一团乱等现象，或是不知道如何准备，或是忘记操作步骤的先后，或是不关注细节，更多的是完全不知道该如何操作。这样一次课下来，学生会产生挫败感，导致对学习本门课程的兴趣和积极性受到打击，且操作课一般具有连贯性，缺乏对其中一个技能的掌握，就会影响到下个技能的学习，如此，会形成一个恶性循环，面对太多的困难，学生便会处于一种想学又不知从何学起的状态；另一方面，课程中的有些操作技能，需要教师不断地重复讲解和演示，这不仅增加了老师的负担，且在学生操作练习过程中，一旦发现某个或小部分学生有不规范或不正确的操作时，教师的关注力将不能分布于整个课堂，这样就很容易忽略其他学生发生的情况。此外，对于中职生来说，本门课程中有一些专业性较强的名词解释和概念定义，如菌落总数、大肠菌群的定义，如果仅有语言描述，学生很难接受并理解。针对上述的种种情况，若能设计一段时长不超过5分钟的生动形象的微视频，学生或能在最短的时间理解并牢记。因此，将微课程引入微生物检验检测课堂，既能解放教师重复劳动的时间，又能使抽象的内容具体化，微观内容宏观化，提高学生学习兴趣进而促进有效课堂的形成。例如：可以将实验准备、样品称量、实验操作等环节分别录制成一段简单视频录像或制做成一段简单有趣的动画，甚至可以设计成一款通关小游戏作为课前预习或课后巩固配合教学。学生可以根据自己的实际情况，随时随地停下来反复学习领悟，琢磨参详。
2.2基于微课资源的教学实践研究
以“项目一细菌菌落总数的检验”为例，在最后的检验报告中有“实测结果”这一栏需要填写，这需要学生能够分析三个稀释度下的菌落数平均值，并根据不同情况选择不同方法进行计算，但对于计算能力欠缺，基础薄弱的中职生来说，这里一直是个难点，而这个难点又恰恰是该项目的重点之一，且另一项目“霉菌和酵母菌的检验”也有这样类似的内容，因此需要学生能够掌握并能运用至实际情况。鉴于此，我们选定“细菌菌落总数的检验——实测结果的计算与报告”为一次微课内容，并根据这个内容的特点选定采用可汗型微课，该类型的微课可使用手写板制作。教师前期需要构思好教学过程，准备好录制时所需材料，比如：确定好三个稀释度及每个稀释度下的菌落数；计算过程；学习效果的检测小练习等。录制结束后再用相关软件进行剪辑、美化、配字幕，最后配音。根据内容特点、学情，尝试采用翻转课堂的教学模式。课前，先将微课视频上传至班级群里，通知学生下载。课上，将课堂分为四阶段，第一阶段，学生在规定的时间内自主学习视频，同时要求将学习过程中遇到的问题记录下来；视频学习结束后，将组内每位成员的问题汇总，小组长组织讨论，组内互相帮忙解决，并列出组内不能解决的问题，张贴于本组的墙上；再采用画廊参观的形式：每组留守一位学生，剩余学生到其他组帮忙解决其他组的问题，且要教会那位“留守”学生，让那位“留守”的学生教会组内其余学生。还有不能解决的问题，教师全部答疑。第二阶段，检查学习情况，完成教师预先准备好的小练习，小练习分三部分，第一部分仅更改数字，其余与视频一样，第二部分更换稀释度，第三部分更换计数范围，这样逐步增加难度，以便检测学生是真的学会了，还是仅仅是依样画葫芦，同时也培养学生的知识迁移能力。第三阶段，以小组为单位对菌落计数的规则进行归纳总结，让学生通过自主学习后能够概括出六种情况，教师再补充非常规情况的菌落计数。第四阶段，实战演练，鼓励学生尝试计算出自己检测报告上的实测结果。在视频学习效果检测后，班级的一位性格外向的学生主动说：“老师，我喜欢这样的方式，完全是根据自己的节奏去把握，这才是我的学习我做主！”这时，其余学生纷纷表示有兴趣，并且自信心更足了，还有学生说自主学习视频时就担心自己学不会，还反复观看了好几遍。
结束语
微时代的到来不仅对我们的生活产生了巨大的影响，也为我们的教育教学提供了更多创新的空间与途径。微课是新时代教学、学习的另一个方向性的导向，是一种以学生为本的教学研究，调动学生所有的感官参与学习，每次小小的量变引发无穷的质变。因为是微课，所以它在广度、深度和复杂度方面还存在不足，这需要在今后的实践中不断完善。总之，微课教学在《微生物检验检测》课程中应用的可能性还需要进一步研究与实践，在课程内容重难点选取、环节设计、内容呈现、交流反馈等许多方面还有待优化，尚需进一步探讨。
作者：张露娟 单位：上海食品科技学校
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微生物中的细菌、放线菌、霉菌及酵母菌等有去除水中的COD和BOD的作用,氮、磷的循环是由聚磷菌、氨化菌、反硝化菌、硝化菌和亚硝化细菌实现的,进而微生物的数量和活性的变化可以反映出水生态的动向;其五,取样方便,微生物实验可以较快取得数据,实验成本较低,使其更容易在水体污染监测中应用。
1微生物指标监测湖泊环境的研究现状
在现阶段的环境评价中微生物指标已经得到广泛的应用。侯春良在唐海湿地生态系统服务功能价值评估和保护研究中表明微生物参与环境的净化,通过微生物的代谢和相互作用调控环境中氮磷浓度,有效降解有机物的浓度[3];丁忠良在黑龙江省湿地生态环境监测指标讨论中,指出微生物的指标包括微生物的种群分布、数量、季节变化、总数、酶类与活性等参数评价湿地的生物多样性具有客观性、实效性,微生物其生长繁殖速度快、适应能力强,所以这样的评估方式更能直观快速的反应湖体的变化[4];杨永兴在研究湖泊的特点时说明在水域变化的过程中有着适应不同变化的微生物群体,伴随这水域环境的变化微生物有这明显的潜育化过程[5]。
2微生物指标在分子水平上的研究
由于自然界中99％的微生物在目前的培养技术下还不能被培养[6],这就极大的限制了人们对微生物种类和数量的认识和了解,但目前分子生物学如16SrDNA技术、变性梯度凝胶电泳技术、宏基因组文库技术等,以及生物信息学应用于极大的促进了人们对于微生物遗传多样性及微生物种群和功能的认知。
PCR-RADP是采用对某一特定基因的非特异性的引物来扩增某些片断,操作简便,引物实用性广,对于结果准确性要求比较不高以及亲缘关系近的种属有较高的可信度。SSCP技术基因指纹技术(geneticfingerprinting)是近年来在微生物群落监测中的应用中迅速崛起的用于分析微生物群落的结构、动态等特征的技术,该技术不需要对微生物进行培养。rRNA基因同源分析方法是多种分子生物学技术的组合,它通过对微生物的rRNA进行分析揭示微生物的多样性是微生物分子生态学的重要方法,目前已经取得了大量的成果。
广谱PCR技术16SrDNA常被用于细菌鉴定,在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性,根据这些保守区可以设计出细菌通用物,可以扩增出所有细菌的16SrDN段,并且这些引物仅对细菌是特异性的,因此,16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。
作者：王通 季宇彬 任智智 单位：哈尔滨商业大学
关键词：林地；土壤微生物；土壤肥力；影响因素；展望
1 林地土壤微生物研究概况
森林土壤微生物是栖居在森林土壤中的细菌、放线菌、真菌、显微藻类和原生动物等微小的生物，是森林生态系统的组成成分之一。在生态系统中，微生物分解有机质并将其转化为无机物，使之重新被植物利用，是分解者；同时，微生物又可将无机物合成为有机物，并转化有机物，因而又是生产者。土壤微生物与植物在根际微环境中进行着复杂频繁的互作。土壤有益微生物通过其代谢活动，提高土壤中植物营养元素的有效性，改变了植物根系生理状态，最终促进了植物的定植、生长和发育；植物通过其根际分泌物影响着土壤微生物的群落结构和代谢活性。土壤微生物与植物相互作用不是完全独立的，还受到土壤、温度、水分等多种环境因素影响，进一步研究植物、土壤微生物与环境关系，特别是研究植物——土壤——微生物所构成的系统可为今后进行绿色农业、林业保护和环境保护等提供更有价值的信息。20 世纪70 年代以来， 国内外对森林土壤微生物进行了广泛深入的研究。其中，在林地土壤微生物区系、根际微生物区系、微生物在土壤养分转化与循环、生态平衡、土传植物病害、固氮作用以及林业技术措施对土壤微生物影响等方面做了大量工作[1]。
2 林地土壤微生物数量与土壤肥力的关系
土壤微生物直接参与土壤中碳、氮的循环，土壤腐殖质的形成以及无机元素的转化过程，在土壤的形成和创造肥力的过程中起着极为重要的作用，土壤微生物的种类和数量是评价土壤肥沃程度的一个重要指标。因此，通过对土壤中微生物数量的测定，可以了解土壤的肥力状况。
林地土壤中3大类微生物的数量，通常是作为森林土壤生物活性高低的重要标志之一。在森林土壤生态研究中，通常把芽孢杆菌、荧光杆菌及一些有色细菌的数量作为森林土壤肥力高低的重要标志。土壤微生物数量直接影响土壤生物化学活性及土壤养分的组成与转化，是林地土壤肥力的重要指标，其作用大小可用偏相关系数衡量。真菌与有机质极显著相关，与全氮、全磷、有效钾显著相关；细菌与有效氮、有效磷极显著相关；放线菌与全磷显著相关；土壤微生物总量与土壤水解氮、速效磷呈显著正相关[2]。因此，可以用土壤微生物数量来判断土壤肥力状况。
3 林地土壤微生物数量的影响因素
土壤微生物数量随林型、植被不同而变化。黑松×刺槐、黑松×麻栎、黑松×紫穗槐混交林均高于黑松纯林。松柏混交林土壤微生物数量高于松树纯林和无林地。苏南丘陵区黄棕壤上阔叶林、针阔混交林>针叶林；混交林>纯林；林地>荒地。油松刺槐混交显著改善了林地土壤生物学特征，土壤细菌、真菌和放线菌以及固氮菌、磷细菌、钾细菌的种群数量较纯林均明显增多，土壤质量明显改善。
土壤微生物数量随林龄改变而表现出一定的动态变化趋势。马占相思林和柚木纯林土壤微生物，其数量随林龄增加而增加。杉木人工林不同发育阶段土壤微生物数量变化趋势为高——低——高。究其原因，从幼龄林到中龄林，随着林冠的郁闭，林下植被盖度急剧下降，而从中龄林到成熟林随着密度及郁闭度下降，林下植被盖度逐渐得到恢复，从而使微生物总数呈现出高——低——高的规律性变化。土壤微生物的总量变化除与林木的生长有关外，还与土壤含水量及温度有一定的相关性。
微生物数量在森林土壤不同土层中分布不同。曾思齐对湘东丘陵区次生林下土壤0～20 cm、20～40 cm、40～60 cm、60～80 cm 土层的微生物数量进行分析，结果表明土壤微生物主要分布在0～20 cm的土层。随着土层加深，微生物数量迅速减少，呈现自上而下逐渐减少的趋势。
在不同的土壤类型上微生物数量有差别。土壤微生物在有机质含量高，水热状况及通气性良好的土壤中居多，也就是说土壤理化性状优良的土壤的微生物数量更多。
4 研究展望
目前我国森林土壤微生物的研究较多，但与欧美国家相比仍存在较大差距，整体研究水平亟待提高。因此追踪国际森林土壤生物学发展的前沿和热点，深入新领域、新技术的研究与开发。为此，应特别关注以下两个方面的研究工作：①森林土壤微生物与环境变化。重视森林土壤温室气体变化规律研究，进一步探讨温室气体浓度升高条件下森林土壤微生物的响应机制和生物学机理。②森林土壤微生物多样性及功能。采用分子生物学技术、同位素标记技术深人分析土壤物质与养分循环过程及相关的土壤微生物生物类群。
参考文献
[论文摘要]：目前，微生物采油技术引起了微生物学界、石油工业界、石油地质界和地球化学界等相关学科的广泛兴趣和关注。详细介绍微生物采油技术概况，明确分析微生物采油技术概况机理，并探讨其发展方向。
微生物原油采收率技术(microbialenhanancedoilrecovery，MEOR)
是利用微生物在油藏中的有益活动，微生物代谢作用及代谢产物作用于油藏残余油，并对原油/岩石／水界面性质的作用，改善原油的流动性，增加低渗透带的渗透率，提高采收率的一项高新生物技术。该项技术的关键是注入的微生物菌种能否在地层条件下生长繁殖和代谢产物能否有效地改善原油的流动性质及液固界面性质。与其它提高采收率技术相比，该技术具有适用范围广、操作简便、投资少、见效快、无污染地层和环境等优点。
一、微生物采油技术概况
1926年，美国科学家Mr.Beckman提出了细菌采油的设想。1946年Zobeu研究了厌氧的硫酸盐还原菌从砂体中释放原油的机理，获得微生物采油第一专利。I．D．shtum(前苏联)及其它国家等学者也分别作了大量的创新性工作，奠定了微生物采油的基础。美国的Coty等人首次进行了微生物采油的矿物试验。马来西亚应用微生物采油技术在Bokor油田做先导性矿物试验，采油量增加了47%。2002年至2003年，我国张卫艳等在文明寨油田进行了微生物矿场应用，累计增产原油1695t，累计少产水1943t，有效期达10个月。
美国和俄罗斯在微生物驱油研究和应用方面，处于世界领先地位。美国有1000多口井正在利用微生物采油技术增加油田产量，微生物采油项目在降低产水量和增加采油量方面取得了成功。1985年至1994年，俄罗斯在鞑靼、西西伯利亚、阿塞拜疆油田激活本源微生物，共增产原油13.49x10t，产量增加了10～46％。1988年至1996年，俄罗斯在11个油田44
个注水井组应用本源微生物驱油技术，共增产21x10t。
20世纪60年代我国开始对微生物采油技术进行研究，但发展缓慢。80年代末，大庆油田率先进行了两口井的微生物地下发酵试验(30℃)。大港、胜利、长庆、辽河、新疆等油田与美国Micro～Bac公司合作，分别进行了单井吞吐试验。1994年开始，大港油田与南开大学合作，成功培育了一系列采油微生物，该微生物以原油和无机盐为营养，具有降低蜡质和胶质含量功能，并在菌种选育与评价、菌剂产品的生产、矿场应用设计施工与检测等诸方面取得了成绩。1996年以来，吉林油田与13本石油公司合作，探究了微生物采油技术在扶余油田东189站的29口井进行的吞吐试验，21口井见效，见效率达70%。2000年底，大庆油田采油厂引进了美国NPC公司的耐高温菌种，在Y一16井组进行了耐高温微生物驱油提高采收率研究和现场试验，结果表明，采收率达43.41%，增加可采储量1.81×10t，施工后当年增油615.5t。胜利油田罗801区块外源微生物驱油技术现场试验提高采收率2.66%。
二、微生物采油技术机理
（一）微生物采油技术与油田化学剂
在大庆油田开发的各个阶段都会使用不同性质的化学剂，现以大庆油田为例。当大量化学剂进入油藏后，将发生物理变化和化学变化，对微生物采油过程可能产生不同的影响。化学剂既可引起微生物生存环境（渗透压、氧化还原电位、pH值）的改变，又可直接改变生物的生理（呼吸作用、蛋白质、核酸及影响微生物生长的大分子物质的合成）以及影响微生物细胞壁的功能，从而影响微生物的生长，降低采收率。
（二）微生物驱油机理
因为，微生物提高原油采收率作用涉及到复杂的生物、化学和物理过程，除了具有化学驱提高原油采收率的机理外，微生物生命活动本身也具有提高采收率机理。虽然目前的研究不断深入，但仍然无法对微生物采油技术各个细节进行量化描述，据分析，主要包括以下几个方面：
1.原油乳化机理。微生物的代谢产物表面活性剂、有机酸及其它有机溶剂，能降低岩石一油一水系统的界面张力，形成油一水乳状液（水包油），并可以改变岩石表面润湿性、降低原油相对渗透率和粘度，使不可动原油随注入水一起流动[1引。有机酸能溶解岩石基质，提高孔隙度和渗透率，增加原油的流动性，并与钙质岩石产生二氧化碳，提高渗透率。其它溶剂能溶解孔隙中的原油，降低原油粘度。
2.微生物调剖增油机理。微生物代谢生成的生物聚合物与菌体一起形成微生物堵塞，堵塞高渗透层，调整吸水剖面，增大水驱扫油效率，降低水油比，起到宏观和微观的调剖作用，可以有选择地进行封堵，改变水的流向，达到提高采收率的效果。在较大多孔隙中，微生物易增殖，生长繁殖的菌体和代谢物与重金属形成沉淀物，具有高效堵塞作用。
3.生物气增油机理。代谢产生的CO、CO2、Nz、H、CH和C3H等气体，可以提高地层压力，并有效地融入原油中，形成气泡膜，降低原油粘度，并使原油膨胀，带动原油流动，还可以溶解岩石，挤出原油，提高渗透率。
4.中间代谢产物的作用。微生物及中间代谢产物如酶等，可以将石油中长链饱和烃分解为短链烃，降低原油的粘度，并可裂解石蜡，减少石蜡沉积，增加原油的流动性。脱硫脱氮细菌使原油中的硫、氮脱出，降低油水界面张力，改善原油的流动性。
5.界面效应。微生物粘附到岩石表面上而生成沉积膜，改善岩石孔隙壁面的表面性质，使岩石表面附着的油膜更容易脱落，并有利于细菌在孔隙中成活与延伸，扩大驱油面积，提高采收率。
（三）理论研究
1.国内外的数学模型。20世界80年代末，国外的Islam、Zhang和Chang等建立了微生物采油的数学模型并开展了相应的数值模拟研究。Zhang模型优于Islam模型在于可描述微生物在地层中的活动，却难于现场模拟。Chang模型是三维三相五组分，能描述微生物在地层中的行为，不能描述在油藏中的增产机理。
2.物理模拟。物理模拟研究基本上是应用化学驱的物理模型试验装置及试验过程。微生物驱油模型的核心是岩心管部分，其长度影响微生物的生长繁殖。应建立大型岩心模型，使微生物充分繁殖，便于分析研究微生物的驱油效果。通过物理模拟研究微生物驱油法，可获得微生物在岩心中的推进速度及浓度变化，对岩心渗透率的影响等信息。
（四）源微生物的采油工艺
国内油田（大庆等）已进人高含水开发期，是采用内源微生物驱油还是采用外源微生物驱油，要根据具体油藏内的微生物群落进行分析。若具体油藏中内存在有益微生物驱油的微生物群落，宜采用内源微生物驱油工艺，这是目前国内致力于运用最新微生物采油技术。
三、结语
综上所述，在我国油田中，特别是大庆油田，在微生物采油技术具有提高采收率的效果，对大多数的油藏都能充分发挥微生物采油的优势。制约微生物采油技术的主要因素在于油藏中微生物群落结构、现场试验工艺及物理模拟实验的局限性。外源菌种的选育和评价指标、特性，微生物的研究、菌液的生产和矿场试验等方面还需深化。
参考文献：
关键词 : 微生物检验;研究进展;发展趋势;
在诸多领域的工作中都涉及微生物检验环节，如食品、药品等的检验，对保障相关产品的质量具有重要作用。微生物检验也是实验室检测的重要手段，根据检测需要和实际情况采取相应的微生物检验手段能更好地提升微生物检验效果与水平，这就需要相关人员不断深入研究微生物检验技术，把握好微生物检验的发展趋势，使其在相关工作中得到更好的应用。
1、 微生物检验技术概述
微生物检验主要是对部分产品（一般是口服的食品、药品）中的微生物污染开展定性或者定量检验的技术。该技术涉及诸多领域与行业，如食品、饮用水、外用或口服的药品、需灭菌的产品和化妆品等，此类产品卫生标准有明确的规定，通过微生物检验技术对其微生物污染实现严格控制，避免各类有害病原微生物侵入人体而对广大消费者的健康造成危害。在微生物的常规检验中，主要的测定内容有需氧菌的总数、霉菌的总数、肠道的致病菌、化脓性的致病菌、食物的中毒菌、破伤风的厌氧菌、活螨虫和螨虫卵以及大肠菌群等。在微生物检验中，一定要严格执行检验的程序，在样品检验前一定要对操作的环境提前采取灭菌处理，操作期间谨防出现二次污染[1]。
在微生物检验中，基本操作有接种、分离纯化、培养、鉴定和保存等。在接种方面，常用的方法有划线接种、三点接种、穿刺接种、浇混接种、涂布接种、液体接种、注射接种、活体接种等。对培养基完成高压灭菌后，通过已灭菌处理的工具在无菌条件下进行含菌材料向培养基上接种。在分离纯化方面，若一个菌落内的所有细胞都来自一个亲代细胞，此菌落就被称作纯培养。在鉴定菌种时，用到的微生物要求是纯培养物，而纯培养物的获取就是分离纯化的过程，方法也有很多，如倾注平板、涂布平板、平板划线、富集培养、厌氧处理、单细胞分离等。在培养方面，以培养时对氧气的需求情况为标准，可以分为好氧培养、厌氧培养；以培养基的物理状态为标准，可以分为固体培养、液体培养。在鉴定方面，主要涉及形态学的观察、生理生化的试验、化学成分的分析、基因型的分析、系统发育的分析等内容。在保存方面，基本原理是挑选优良的纯培养物，使其处于休眠状态，然后人为创造有利于其休眠的环境，使其在长期保存后依然具备菌种原有的优良特性[2]。比较常用的方法有定期移植方法、液体石蜡方法、真空冷冻干燥法、低温冻结方法等。
2、 基因检测在微生物鉴定中的应用进展
在微生物鉴定中，基因检测是一种新技术，目前已经研究出下一代测序（Next Generation Sequencing,NGS），此方法主要是对大量DNA的小片段进行检测，通过特定算法对个体检测的数据与参考基因的序列实施对比，发现可能存在的变异情况。以医学临床中的微生物检验为例，NGS可以用于感染性疾病病原体的鉴定。对病原微生物的传统鉴定方法主要包括涂片镜检处理、分离培养、质谱和生化反应等，但此类方法呈现出周期长、灵敏度低和过程复杂等缺点，对分枝杆菌的菌种鉴定用时需30～40 d，对苛养菌、病毒等的培养条件也极为苛刻，大大增加了培养的难度。分子诊断基于聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）有效解决了上述病原体的鉴定问题，但不能解决未知的微生物检验难题，因为未知的微生物核酸序列也未知，无法设计引物，这也成为该技术最大的难题[3]。在NGS检测中，不需要对病原体实施分离培养处理，也不依赖已知的核酸序列，能直接实现标本的测序、鉴别，有效节省了检测时间、提升了诊断效率，在对未知物种和难培养病原体的鉴定中具有显着的优势。在对病原体的鉴定中，NGS的应用主要包括两种方法，分别是r RNA基因测序、全基因组测序（Whole Genome Sequencing,WGS）。其中，r RNA基因测序法在临床上主要用于细菌和真菌等鉴定，也是菌群分析环节的基础；WGS和r RNA基因测序方法相比，WGS能获取更加全面的信息，适合在病毒的鉴定中使用。大部分的病毒是不可培养的，且存在高度变异的情况，NGS和基因芯片、Sanger测序法等相比，NGS具有更高的效率，也不需要设计特定探针，适用于复杂的临床标本病毒鉴定。
3 、微生物鉴定技术的研究进展
微生物鉴定的定义是以现有的分类系统对未知微生物的特征实施测定，以对其实施细菌、霉菌和酵母菌等大类区分，或对属、种和菌株水平进行确定的过程。在鉴定污染微生物时，一般结合鉴定的水平合理选择鉴定的方法。在微生物的鉴定中，传统方法（经典的生化反应、革兰氏染色的显微镜鉴别等）一般适用于大多数非无菌类药品的生产以及部分无菌生产环境中的风险评估。但在药品的微生物污染相关事件中，通过传统的方法并不能满足快速分型、准确鉴定和溯源分析等需求，所以，研究分子生物学时产生的基因型鉴定法逐渐得到应用[4]。
采用传统技术鉴定表型主要包括菌落形态的观察、染色、生化鉴定、显微镜检查等环节，呈现出成本低和便于操作等优点。但微生物表型存在一定的可变性，不同的生长环境会对其表观形态产生影响，如不同培养基内的微生物可能有不同的颜色。同时，传统表型鉴定技术对人员经验和培养条件较为依赖，在一些生长缓慢、培养难度大、需特殊营养的微生物鉴定中具有很大的局限性。随着社会的发展，现代化的微生物鉴定技术逐渐在药品污染的微生物鉴定、溯源分析以及污染调查等方面得到广泛运用，此类技术实现了对传统表型鉴定的拓展与丰富，如生化鉴定系统（如VITEK和API的系统）、FTIR（傅里叶红外光谱）、MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）、以碳源分析为基础的全自动化微生物鉴定系统、脂肪酸鉴定系统等，有效提升了微生物的鉴定效率和药品质量的控制水平。
随着鉴定技术的发展，基因型鉴定技术被研发出来，这是一种以微生物的基因序列为基础，对其分子实施生物学鉴定的技术，不依赖微生物的培养，是一种现代化的鉴定技术类型。基因型鉴定技术和表型鉴定技术存在很大不同，其数据库较为完善，能以微生物的遗传物质为基础，通过差异分析对微生物进行鉴定，呈现出高效率、高准确度和高通量等特点。在自然环境中，约有10%的物种能以分离培养的方法获取，以微生物的培养为基础的传统表型鉴定具有很大的应用局限性，而采用基因型鉴定，以16S r RNA的高通量式测序法获取的微生物群落信息就十分全面。当然，基因型鉴定也有一定的缺陷，使用16S r RNA法时，不能对某些亲缘较近、不明显的特征序列类微生物进行准确鉴定；采用高通量的测序分析混合样本时，不能有效排除已死亡的微生物干扰因素等[5]。
4、 微生物检验技术的发展趋势
在微生物检验技术的发展过程中，逐渐产生了很多技术类型，各有优缺点。为了有效地弥补各检验方式的缺陷，可以对多种方式实现联合运用。在选择检验方式时，需要综合考虑相应条件，特别是检验中对灵敏度的要求。因此，提升灵敏度、消除假阳性是检验技术研究过程中的重要关注内容。在计算机技术迅速发展的背景下，微生物检验技术朝着高度自动化以及简便快速的方向发展。目前，分子生物学相关技术在自动化的仪器联合中，已经被运用于病原菌的诊断和鉴定、耐药基因的检测等方面。要想实现高质、高效和价格低廉等有效统一，就要改变临床中病原菌的检验现状以及传统观念，在各学科的交叉发展中，新型检验技术也会越来越多。
近年来，新型技术得到了迅速发展，如电化学和比浊法等技术，可以对药品内的活微生物实现直接测定；固相细胞的计数法以及流式细胞的计数法等，能分析微生物细胞内的特定成分。上述技术能提高药品检测的准确性，也能保证检测人员的安全，因此，应用前景十分广阔。基于技术的迅速发展，要想实现药品中微生物检验的进步，还要完善检验标准，提升相关检验人员的综合素质和专业水平。因为药品检验期间需要人工操作，操作人员的技术水平会对检测结果产生直接影响。为了提升操作人员的技术水平，要对检测人员开展定期培训。目前，在药品微生物的检验中，软硬件设备都得到了显着改善，且药品的微生物检验技术也朝着标准化方向发展，特别是对无菌制剂的研究已取得显着成就，推动着检验项目和方法、药典制定的依据等朝着更科学的方向发展[6]。
5 、结语
微生物的检验在诸多领域得到了应用，也逐渐产生了很多检验技术和方法，各有优点与不足。为了促进相关技术作用的充分发挥，还需要对检验技术不断进行研究，把握好检验技术的发展趋势，推动检验技术的现代化发展。
参考文献
[1]白梅临床微生物检验的快速诊断技术研究进展[J]家庭医药，2018(7):59.
[2]李茂峰.食品微生物快速检测技术及其自动化研究进展[J].食品安全导刊, 2017(18):120.
[3]王颖临床微生物快速检验技术研究进展[J]医药前沿, 2017(23):6-7.
[4]郑小玲,王银环,陈君豪,等药品微生物检验替代方法国内外研究进展[]药物分析杂志, 2020(4):8-13.
【关键词】微生物；采油；低渗透；油藏；机理
微生物采油技术是一种新型提高油藏采收率的新型采油技术，通过微生物的新陈代谢的作用，使原油中重组分在物理化学作用下，不断的分解，进而减少原油的重组分含量，降低了原油的比重和原油的粘度，提高了地层原油的流动能力。微生物的化学作用还能降低地层岩石表面的界面张力。微生物与石油作用产生的代谢产物可以有效提高地层原油的流动性。增加地层岩石的空隙度和渗透率，微生物在油藏中的作用活动主要和地层的性质、流体的性质、温度、压力等因素有关，这些环境都会影响到微生物采油技术的效果。开展微生物采油技术的研究，对于提高我国低渗透油藏的采油效率具有重要的意义。
1.低渗透油藏微生物采油技术的作用机理研究
在利用微生物采油的过程中，在微生物和原油作用下可以产生酶类代谢产物，这种酶类可以实现原油中重质组分和石蜡的分解，分解之后原油凝固点会逐渐的减小，从而降低原油的流动性，降低了流动阻力，提高了原油流向井底的速度和效率，增加原油的产量。
在地层中微生物的代谢作用可以产生各种气体，例如二氧化碳、氮气、甲烷等气体，这些气体的产生可以有效的提高地层的原油的压力，而且这些气体可以溶解到原油中，降低了地层中原油的粘度，加快了原油流动的速度，减小的原油的流动阻力，从而提高了原油的产量。当微生物进入水驱地层后，微生物和微生物的代谢产物会和地层中的重金属形成沉淀，生成的沉淀物可以有效的堵塞水窜地层，这种方法封堵效果好，特别是对于非均质地层，注水调剖的效果非常明显，可以提高油藏的产量和采收率。
同时微生物反应产生的聚合物，能够有效的控制地层的流度比，加大了微生物采油技术的扫油面积和波及系数。当微生物进入到油井后，在微生物和其代谢产物可以和油井内还有油井附近的原油发生反应，降低了油井和油井附近处堵塞的概率，提高原油的开采效率。在微生物的作用下，可以产生各种生物有机酸，这些酸类可以和地层岩石反应，提高了岩石孔隙度和渗透率。微生物和原油反应代谢的产物中，有多糖类和黄胞酸胶等成分，该类物质增加注水井注入水的粘度，较小油水的流度比，有效的防治了水窜现象的发生。
油藏地层中的岩石具有大量的空隙和微裂缝，当地层岩石中的流道的直径为较小时，地层之间地层连通性较差，油藏的渗透性较差，原油的流动性较差。由于利用微生物采油技术，微生物的分布广，数量多和繁殖能力强，随着时间的推移，微生物的数量会不断的增多，地层孔隙度可以得到有效的提高，地层中的流体的渗流能力也得到有效的提高，同时可以降低注水井的注水压力。微生物的新陈代谢过程中，可以分解成多种无机盐和有机盐，可以使地层中污染得到有效的分解，疏通地层中的孔道，提高了地层的渗透率。
在石油开采的过程中，随着原油从井底不断的向上流动，原油的温度不断的下降，原油中轻组分不断的逸出，同时溶解在原油中石蜡也随之析出，石蜡析出后吸附到套管和油管中，形成石蜡的沉积物。在微生物采油技术中，微生物可以对石蜡进行分解，其作用后的代谢产物，可以实现石蜡的溶解、乳化作用，进而改变石蜡沉积物的性质，防止了石蜡的沉积和堵塞。石油微生物在与地层中反应中，改变了原油的物理化学性质，可以降低原油中重质组分的含量，减小井底原油的粘度，微生物代谢的产生的表面活性剂，可以有效的防止蜡晶的形成，降低了蜡晶形成沉积速度。微生物及其代谢产物和地层岩石之间的相互反应可以溶解部分地层的岩石，从而提高地层岩石的孔隙度和渗透率。
2.低渗透油藏微生物采油技术现场试验研究
微生物采油技术主要适用于低渗透油藏，油藏的产量低，渗透性差。在低渗透油藏现场实验选井方面，选取的地层原油粘度大，凝固点高的油藏，利用常规的采油方法不能够实现连续开采的油藏。通过微生物采油技术三十多口井的现场试验结果表明，利用微生物采油技术可以平均提高油井的日产油一吨左右，而且提高产量的持续时间长，可以达到两百多天以上，其中效果最为明显的一口油井，通过采油微生物采油技术之后，单井日产量提高了四吨多，而且已经累计提高单井产量达到六百多天，结果表明利用生物采油技术提高低渗透油藏的产量效果明显。
通过现场试验结果表明，不同的微生物种类对于提高油藏产量和采收率的效果不同，而且对于不同类型的油藏效果也不同，微生物采油技术最佳的微生物生长温度为四十摄氏度左右，在中渗透油藏中，微生物采油技术的效果最为明显。为了能够更好的保证微生物采油技术的技术优势，在进行微生物采油技术之前，需要对油藏进行全面和细致的分析，确定油藏是否适合微生物采油技术，而且要进行微生物的种类和油藏条件的配伍性实验，选择出最佳的微生物种类和最佳的微生物采油的技术条件，为低渗透油藏微生物采油技术的取得成功打下基础。
3.结束语
微生物采油技术是一种新型的采油技术，和其他三次采油技术的技术原理区别较大，该技术对于地层的伤害大，不会对油藏的开采产生副作用，通过微生物及其代谢产物和原油的相互作用，可以有效的降低原油的粘度，减少原油重质组分的含量，提高原油的流动能力，同时还可以和岩石相互反应，有效的提高地层岩石的空隙度和渗透率。文章通过调分析，研究了低渗透油藏微生物采油技术的作用机理，并且通过现场试验验证了利用微生物采油技术开采低渗透油藏的优越性，在进行微生物采油技术之前，要进行详细细致的分析与评估。通过研究为增加低渗透油藏采油率，提高油田的产量和经济效益奠定了基础。
【参考文献】
1发展概况
微生态制剂包括益生菌、益生元、合生素。1947年，Mollgoard首先发现使用乳酸菌饲喂仔猪可有效的增加仔猪的体重并改善仔猪的健康。我国对微生态制剂的研究始于20世纪70年代，由于其作用显著，且大大减少使用抗生素导致的二次污染，近年来广泛的应用于动物生产中。微生态制剂所用的芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等，都以内生孢子形式存在，其能分泌较强活性的胞外酶，有利于提高消化率，提高动物生产性能，芽孢杆菌为好氧菌，通过生物夺氧方式维持瘤胃微生态平衡，减少疾病。
2作用机制
2.1优势种群作用
正常动物肠道中达到微生态平衡时，有益微生物占优势种群，当机体发生应激反应或由于抗生素过量与不当使用，打破肠道中菌群的平衡。通常来说，动物肠道厌氧菌占据绝对优势，但肠道中菌群平衡被破坏可使需氧菌和兼性厌氧菌数量大幅增加，而使用微生态制剂可以有效补充益生菌、益生元、合生元等，进而使得肠道微生态达到新的稳态水平，抑制动物机体发病。
2.2产生多种消化酶
微生态制剂在动物体内能够产生多种消化酶。芽孢杆菌能产生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，加速分解营养物质，进而提高饲料消化率和有效利用率。有研究表明，利用不同的芽孢杆菌制成微生态制剂饲喂动物，均能提高消化道的酶活性，认为芽孢杆菌提高动物消化酶活性是微生态制剂促进动物生长作用的一个重要因素。
2.3生物夺氧
畜禽肠道内正常情况下有益菌为厌氧菌，约占99%，厌氧菌含量下降或需氧菌数目大量增加容易导致畜禽肠道失衡，微生态制剂尤其是芽孢杆菌有很强的吸氧能力，能消除肠道中的氧气，进而为肠道中微生物正常繁殖营造一个良好的厌氧环境。
2.4增强免疫功能
大量研究表明，微生态制剂能够促进免疫器官的发育，可使B细胞、T细胞数量增加，提高机体免疫水平。此外，微生态制剂还能产生干扰素，提高免疫球蛋白质量浓度和巨噬细胞活性。如乳酸菌能刺激肠道发生局部免疫反应，提高抗体水平。
2.5生成有益代谢产物
微生态制剂乳酸菌代谢可产生大量乳酸，芽孢杆菌能产生乙酸、丙酸等，使得肠道pH和Eh降低，进而抑制病原菌生长和繁殖，在源头上扼制可能对畜产品品质产生的不良影响。此外，部分乳酸杆菌可产生嗜酸菌素，乳酸菌通过产生广谱抗菌物质改变肠道内微生物的代谢作用。
3微生态制剂在动物生产中的应用
3.1猪
朱五文等在断奶仔猪基础日粮中分别添加枯草芽孢杆菌制剂0.5%、1%、2%，试验结果表明，添加枯草芽孢杆菌制剂的试验组末期平均净增重、日增重和头均耗料均显著高于对照组（P<0.05），料肉比低于对照组（P<0.05）[1]。李春丽等研究了微生态制剂对哺乳仔猪生长及免疫机能的影响，结果表明，试验组的仔猪较对照组仔猪平均日增重提高8.33%，发病率降低30.31%，试验组母乳的免疫球蛋白（IgA）浓度一直维持不变，对照组的浓度下降了4.2%，说明微生态制剂有促进动物生长和增强免疫力的作用[2]。陈春林等探索微生态饲料添加剂对仔猪血液生理生化指标的影响，发现添加微生态饲料添加剂仔猪血清中碱性磷酸酶（ALP）活性、血液淋巴细胞率（LY）含量分别提高20.61%、7.06%（P>0.05）；血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活性分别降低4.46%（P>0.05）、24%（P>0.05）[3]。试验结果表明，发现微生态饲料添加剂对仔猪有促生长的作用，并且能够提高仔猪免疫力，是一种安全、无公害的饲料添加剂。张成等研究指出，添加微生态饲料添加剂与对照组相比，日增重增加6.24%（P<0.05），饲料转化率和腹泻率分别下降5.38%、2.56%[4]。曹书同等指出，在基础日粮中添加微生态饲料添加剂0.8%，保育期仔猪的平均日增重和饲料利用率分别比对照组仔猪提高9.43%（P<0.05）和4.80%（P<0.01），经济效益提高12.29%[5]。刘影等将36头母猪随机分成两组，对照组在各阶段均饲喂基础日粮，试验组在对照组基础上添加枯草芽孢杆菌，结果表明，日粮添加枯草芽孢杆菌可以显著减少哺乳仔猪的腹泻（P<0.05），提高断奶仔猪的重量和断奶活仔数（P<0.01）[6]。尹清强等研究了微生态制剂对断奶仔猪的影响，结果表明，在哺乳仔猪的教槽料和断奶仔猪的保育料中分别加入微生态制剂（全价料中有效菌含量分别为1×106和5×105cfu•g-1）0.05%、0.10%，可维持仔猪胃肠道微生物区系的稳定，使仔猪的腹泻率和死亡率明显降低，且优于抗生素；微生态制剂可改善仔猪肠道的结构，提高胃中蛋白酶和淀粉酶的活力，对于机体免疫力的提高和氧化损伤的保护具有重要作用[7]。因此，微生态制剂是养猪生产中可替代抗生素的一种理想饲料添加剂。
3.2家禽
顾金等研究指出，添加枯草芽孢杆菌0.03%、酵母菌0.02%和粪肠球菌0.015%的复合制剂能显著提高0~3周龄青脚麻鸡平均日增重（P<0.05）和降低料肉比（P<0.05），显著提高血液中总蛋白和血糖含量（P<0.05）[8]。李笑樱等通过代谢试验研究了饲料中添加微生态制剂芽孢杆菌和粪肠球菌对产蛋后期鸡饲料营养物质表观消化率的影响，结果显示，添加芽孢杆菌0.02%、复合微生态制剂0.03%可显著提高蛋鸡日粮代谢能、干物质、粗蛋白质、钙磷表观消化率以及丝氨酸、谷氨酸、精氨酸等氨基酸表观消化率（P<0.05）[9]。翟维等在AA肉鸡基础日粮中添加芽孢杆菌，结果全期采食量、料肉比、死亡率、腿畸形率较对照组分别下降1.76%、13.73%、4.81%（P>0.05）、13.25%[10]。赵希彦在肉仔鸡基础日粮中添加芽孢杆菌制剂0.2%，试验组1~6周日增重较对照组增加；1~6周料肉比下降；全期肉仔鸡的成活率提高，发病率、死亡率降低，21日龄时，胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数提高，42日龄时，试验组胸腺指数、法氏囊指数、脾脏指数提高提高，试验组NDV抗体效价在7、14、21、42日龄分别提高4.8%（P>0.05）、7.3%（P<0.05）、30.3%（P>0.05）、32.2%（P<0.01）[11]。张亚兰等选用7日龄的艾维茵肉鸡100羽，研究两种芽孢杆菌制剂对肉鸡生长性能的影响，结果表明，两芽孢杆菌组肉鸡末重、净增重、日增重均极显著高于对照组（P<0.01），利用芽孢杆菌Pab02和PAS38所制成微生态制剂按0.1%的剂量添加在日粮中于夏季饲喂肉鸡，能够抵抗热应激带来的消极影响，提高肉鸡增重与料肉比，提高其生长性能，并且其作用优于抗生素及寡糖制剂[12]。#p#分页标题#e#
3.3反刍动物
王金合等分离和筛选出3株有益菌研制微生态制剂，对架子牛血清生理生化指标的影响进行研究，试验结果表明，测定甲状腺功能亢进或低下的3个关键指标（FT3、FT4、TSH）试验前后变化属正常范围，超敏促甲状腺素（TSH）增加甲状腺合成并分泌甲状腺激素T3和T4，而T4、T3又反馈抑制TSH的释放；生长激素和胰岛素样生长因子含量高于对照组，但差异不显著（P>0.05）[13]。结果表明，微生态饲料添加剂对肉牛血清中生理生化指标无不利影响，是安全绿色的饲料添加剂。王金合等通过按混合精料的1.0%、1.5%、2.0%比例添加微生态饲料添加剂，试验组比对照组平均增重提高5.5.%、21.3%、26.1%，料肉比分别下降5.96%、18.14%、21.19%[12]。王振华在奶牛基础日粮的水平上添加不同剂量的高产酶活枯草芽孢杆菌微生态制剂作为试验组，对照组正常饲养，分别统计分析不同时期各组的产奶量和奶成分，结果表明，高产酶活枯草芽孢杆菌制剂可提高泌乳牛的产奶量，并且不同的添加剂量对泌乳量的提高数量不同[14]。在提高泌乳量的同时，减少乳脂率降低，提高乳蛋白的含量。胡红莲等在奶牛基础日粮中分别添加枯草芽孢杆菌型制剂200和300g•t-1作为试验组，与对照组相比，奶产量分别增加了0.70%、11.61%，较添加前分别提高7.22%、16.71%，且对体细胞数有一定的影响作用，在一定程度上，高剂量（2.1g•d-1•头-1）较低剂量（1.4g•d-1•头-1）有降低体细胞数的趋势，可改善牛奶卫生指标[15]。栾广春等在奶牛基础日粮中分别添加Na型纳豆芽胞杆菌30、60g•d-1•头-1作为试验组，对照组不添加，结果表明，添加芽孢杆菌能显著提高产奶量（P<0.05）、改善乳脂率、提高乳蛋白率（P<0.05）、增加牛奶中干物质含量和降低牛奶中体细胞数[16]。那日苏等在育肥绵羊日粮中添加酵母培养物（10g•d-1•只-1），连续饲喂30d后，处理组日增重比对照组高11.1%，差异不显著（P>0.05）[17]。
3.4水产动物
沈文英等选取三角帆蚌，分别添加地衣芽孢杆菌0（对照）、0.5×106、1.0×106、2.0×106cfu•mL-1，试验结果表明，水体中添加地衣芽孢杆菌可提高三角帆蚌消化酶、免疫指标和抗氧化指标活性，促进蚌体生长；最适添加水平和间隔时间分别为1.0×106cfu•mL-1和15d[18]。管越强等在中华鳖稚鳖基础日粮中分别添加枯草芽孢杆菌0、0.5、1.0、2.0和5.0g•kg-1，结果表明，日粮中适量添加枯草芽孢杆菌可以促进中华鳖稚鳖的生长，降低饲料系数，提高肠道淀粉酶和蛋白酶活性，对肝脏、心脏、肾脏和肌肉有保护作用，能降低无氧代谢水平；在中华鳖稚鳖饲料中推荐添加量为1.0~2.0g•kg-1[19]。Samucl等的研究显示，复合微生物制剂作为饲料添加剂，既可促进动物的生长，又可改善养殖环境[20]。Ziaei等研究表明，在饲料中添加复合微生物制剂能显著提高印度明对虾肠蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性[21]。王彦波等在养殖鲫鱼的试验中发现光合细菌降解氨氮的能力较强，而芽孢杆菌将NO2-N的能力较强，而将两种菌混合使用时，不但起到了互补的作用，而且化学耗氧量（COD）的降解率大幅提高[22]。仇明等在斑点叉尾鮰的日粮中分别添加微生态制剂（枯草芽孢杆菌）100、300、500、700mg•kg-1，结果表明，试验组血液中血糖、白细胞、血红蛋白等指标均显著高于对照组（P<0.05），且添加枯草芽孢杆菌700mg•kg-1组血糖、血红蛋白含量最高；随着枯草芽孢杆菌添加量的增加，尿素氮呈显著降低趋势；试验组对饲料中粗蛋白、粗脂肪、钙、总磷的表观消化率均显著高于对照组（P<0.05），且以添加枯草芽孢杆菌700mg•kg-1组的消化率最高[23]。
【摘要】 植物体内大量分布的微生物对植物产生的影响已成为人们关注的热点，特别是那些有益的影响可对植物的生长及活性成分的形成产生一定的作用。甘草作为一种大宗中药，其栽培品的质量一直是人们所关心的问题，甘草有益微生物对提高甘草的品质有重要作用。该文综述了甘草有益微生物的研究进展，以期对提高栽培甘草的质量起到指导意义。
【关键词】 甘草; 内生菌; 根瘤菌; 菌根真菌
甘草是豆科甘草属(glycyrrhiza)植物，其根及根茎为常用中药，市场需求量大。近年来，随着野生甘草资源的急剧减少，且国家明令禁止采挖野生甘草，使甘草供求矛盾日益尖锐。在这种情况下，对甘草资源的保护性利用及栽培甘草势在必行。近年来，随着人工甘草种植面积的逐年加大，提高甘草的质量成为亟待解决的一个关键问题。相关研究表明，植物有益微生物可以产生促植物生长的活性物质，提高植物固氮性能，促进植物对恶劣环境的适应，加强系统的生态平衡，保证寄主植物健康生长。因此本文就近年来甘草有益微生物的研究进展进行综述，以期对提高栽培甘草的质量有指导意义。
1 甘草内生菌的研究现状
内生菌是指一生或至少一生中的某个阶段能进入活体植物组织内，并且不引起明显组织变化的真菌或细菌［1,2］。1993年，strobel等［3］从短叶红豆杉taxus brevifolia nutt的树皮中分离出二百多种微生物，其中有一株内生真菌taxomyces andreanae能产生紫杉醇，这一研究结果引起学者对内生菌的广泛兴趣。目前，人们已经从长春花、千层塔、银杏、厚朴等多种植物中分离得到了内生菌，并取得了一些成果。
有学者对甘草内生菌也进行了研究，发现内生菌对甘草产生一系列作用。宋素琴等［4］对采自新疆的健康野生胀果甘草不同组织中的内生菌进行分离，并纯化得到149株细菌和2株真菌，鉴定得出149株细菌分属于13个属，2株真菌分属于青霉菌属penicillium和镰刀菌属fusarium。有学者发现内生菌可通过拮抗病原菌促进甘草生长。饶小莉等［5］从乌拉尔甘草健康植株的根茎叶中共分离到内生细菌98株，并采用平板对峙方法筛选出6株菌株，其对植物病原菌有明显体外拮抗活性，鉴定这6株拮抗菌株分属萎缩芽孢杆菌(bacillus atrophaeus)、多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、paenibacillus ehimensis。龚明福等［6］采用无菌操作技术从野生健康甘草glycyrrhiza uralensis的根、茎、叶、种子、根瘤等组织中分离出内生细菌（endophytic bacteria)125株，其中31株对棉花枯萎病菌(fusarium oxysporum)、棉花黄萎病菌(verticillium dahliae)具有较强的拮抗活性，这31株内生细菌分属于气芽孢杆菌属(aerobacillus sp.)、气单胞菌属(aeromonas sp.)、芽孢杆菌属(bacillus sp.)、黄单孢杆菌属(xanthomonas sp.)、假单胞杆菌属(pseudomonas sp.)、土壤杆菌属(agrobacterium sp.)。另有研究发现，从甘草中分离的有些内生菌还可产生活性物质。韦革宏等［7］从乌拉尔甘草和光果甘草中共分离得到68株内生菌，从中筛选出一个来自乌拉尔甘草的菌株mesorhizobium sp. ccnwgx022，从该菌株发酵液的石油醚提取物中分离得到了十八烷酸内酯rhizobialide，是第一次从内生菌中得到此类物质。另有学者研究了内生菌在甘草不同部位及不同月份的数量变化趋势。林世利等［8］分离出不同月份苦豆子、骆驼刺、苜蓿、铃铛刺、甘草不同部位的内生细菌，研究阿拉尔地区豆科植物内生细菌种群动态。结果显示5月份的苦豆子和甘草植株、8月份的苜蓿植株、9月份的铃铛刺和骆驼刺植株的内生细菌的种类最多。内生细菌种类的分布规律依次为苦豆子中叶＞茎＞根＞种子＞花，苜蓿中根＞叶＞茎＞花＞种子，铃铛刺中茎＞叶＞种子＞花＞根，骆驼刺中根＞茎≥叶＞种子＞花，甘草中茎＞根＞叶＞种子＞花。5种豆科植物生长期中总带菌量平均值在各个月份变化趋势不同，并且各个月份的带菌量处于交替变化之中，说明不同月份5种豆科植物内生细菌的种类和数量不同，同种豆科植物不同组织部位的内生细菌的种类和数量有差异。
2 甘草根瘤菌的研究现状
根瘤菌是与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。这种共生体系具有很强的固氮能力。根瘤菌分快生和慢生两种类型，为化能异养菌。目前有学者已经从甘草中分离得到根瘤菌并进行了一些相关研究。
目前对甘草根瘤菌的研究多体现在根瘤菌的分类上。杨雪颖等［9］通过对西北干旱半干旱地区68株甘草根瘤菌的表型多样性和抗逆性分离研究，发现1个新类群和1个具有较高抗逆性的菌株。对新类群的中心菌株ccnwgx022和高抗性菌株ccnwgx035进行16srdna全序列测定及系统进化研究。结果表明，ccnwgx022和ccnwgx035与中慢生根瘤菌属内参比菌株的16srdna相似性分别大于96.8％和98.3％，判定它们均属于中慢生根瘤菌属。谷峻等［10］采用表型数值分类、16s rdna pcr-rflp分析和box-pcr指纹图谱分析的方法对中国北方地区的甘草根瘤菌进行表型、遗传多样性分析。供试菌株在数值分类聚类分析中约85％的相似水平上产生2个表观群，有11株菌未与已知参比菌株聚群。16sr dna pcr-rflp分析表明，供试的20株菌共产生14种遗传型，表现出丰富的遗传多样性。box-pcr指纹图谱分析进一步证明与甘草共生的根瘤菌的基因组也具有多样性。由此得出结论：在中国北方地区与甘草共生的根瘤菌在sinorhizobium、rhizobium和mesorhizobium属中均有分布。
3 甘草菌根真菌的研究现状
菌根是土壤中某些真菌与植物根的共生体。凡能引起植物形成菌根的真菌称为菌根真菌，大部分属担子菌亚门，小部分属子囊菌亚门。菌根真菌与植物之间建立相互有利、互为条件的生理整体，并各有形态特征，这是真核生物之间实现共生关系的典型代表。根据形态和解剖学的特征，又把菌根分为外生菌根和内生菌根两大类。有学者对甘草菌根真菌进行研究发现菌根真菌可促进甘草的生长。饶小莉等［11］分离了甘草的va菌根，并用三叶草进行单孢繁殖，将繁殖后的菌根真菌回接甘草，结果发现接种了菌根真菌的甘草植株笔长、根粗、茎叶干重和根干重都有较大程度的提高，均比对照显著增加，并且不同处理对植株生长影响不同，得出结论接种va菌根真菌显著促进了甘草的营养生长。jingnan liu等［12］用两种am菌根真菌glomus mosseae与glomus versiforme接种甘草，结果显示接种的甘草相对于对照组在生长的早期和晚期有显著提高，叶摄取磷的量比对照组多，并且根中甘草酸的浓度有所升高，但根部氧化酶活性相对降低了，由此得出结论接种am菌根真菌有可能成为提高甘草药用价值的有效途径。
4 甘草其他微生物学相关研究现状
近年来，对甘草微生物学转化等方面的研究工作也取得了一定成果。谢毛成［13］利用发根农杆菌的ri质粒，以光果甘草种子胚萌发形成的实生苗不同部位为外植体，成功诱导出光果甘草毛状根，并利用tldna中rolc序列中的特异性引物，应用pcr技术对光果甘草毛状根进行了分子水平的鉴定，并利用理化手段对毛状根转化后产生的冠瘦碱进行了薄层定性鉴定，从不同水平上证实了光果甘草毛状根核基因组中已整合了外源ri质粒的t-dna片段。燕飞等［14］利用发根农杆菌r1601对药用植物胀果甘草(glycyrrhiza inflat bat)进行转化，诱导其产生发根。在发根诱导过程中，分别用不同菌液浓度、不同浸染时间对胀果甘草子叶、胚轴进行转化处理，统计、比较各条件下的发根率，结果表明，用稀释2倍的菌液浸染子叶8 min时，发根诱导率最高,为56.49%。何晨等［15］用一株产β-葡糖醛酸酶的菌种hc-12对甘草进行液体发酵转化。通过对菌种复合诱变以及应用系统数值化及灵敏值系统调控技术优化了发酵工艺，把甘草中不足0.1%的甘草次酸的含量提高了20倍以上。经过柱层析及hplc及1h nmr鉴定分离得到了甘草次酸纯品，并通过动物实验验证了发酵甘草于未发酵的生品对照甘草具有抗炎活性和镇痛作用显著性效果。
5 小结
内生菌对甘草的有益作用体现在：①内生菌有促进甘草生长作用，内生菌可与病原菌竞争营养或直接产生拮抗物质而抑制病原菌，从而促进甘草生长。②有些内生菌可产生活性物质。③内生菌在甘草不同部位及不同月份的数量呈现一定的变化趋势。另有研究表明，内生菌能产生与宿主相同的活性物质［3］，王兴红［16］推测内生真菌可能与中药的道地性有密切的关系。这些成果对于甘草内生菌的研究有重要意义。
根瘤菌对甘草的有益作用体现在：根瘤菌能够通过与甘草共生，引起甘草根部或茎部结瘤，将空气中的n2转化为可吸收利用的nh4，从而为甘草提供氮素营养，促进其生长。
菌根真菌对甘草的有益作用体现在：甘草和菌根真菌是一种互惠共生的关系，它们之间可以交换各自所需的物质，甘草借助菌根真菌吸收水分、养分和生长促进剂，而菌根真菌也从甘草中摄取自身生长所需要的糖分和其它有机物。菌根真菌是根系的延长和扩展，且比根系吸收水分、养分的能力大得多，可促进甘草的营养生长，提高甘草的药用价值。
微生物转化对甘草的作用体现在：对甘草进行微生物转化，可提高其有效成分含量，用药效果可得到提高。
总之，微生物是个潜力巨大、尚待开发的资源，对甘草相关微生物进行研究有重大意义，有利于提高甘草的质量，对于中药的可持续发展也将起到重大作用。
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关键词：微生物，环境保护，治理技术
1.微生物技术治理污染水体的可行性及依据
环境中的污染物有些是作为微生物生长的能源和基质，在微生物酶的作用下被矿化;有些则是在多种微生物的共同作用下进行转化，这个过程可能会产生中间产物。进入水体的溶解性有机物，在有氧情况下被好氧微生物氧化分解，形成CO2、H02、N03-、P043-和S042-等无机物，水体得以净化。不溶性固体有机物及死亡的生物体沉到水体底部，在底泥微生物作用下转化成小分子的溶解性有机物进入上层水体，也可被厌氧细菌转化成甲烷和其他无机物。
水质恶化的水体中污染物难以降解的主要原因是环境体系中不存在或存在少量可降解污染物的微生物。即使存在少量可降解污染物的微生物，也会由于竞争和捕食作用等微生物的生态关系使其难以大量繁殖并发挥降解污染物的能力。水体的温度、pH值、盐度和溶解氧等外部环境条件不适的情况下也不利于微生物降解能力的发挥。加之在自然条件下微生物对水体的自净速度是很慢的，必须采取人为的强化措施才能加快这一进程。污染水体的微生物净化技术，本质上是利用微生物的新陈代谢能力及基因的多样性，把污染物转化成无污染的终产物，重新进入生物地球化学循环中。同时，微生物的引入可以增加水中的生物多样性，使水体的各级营养结构趋于稳定并保持平衡。
2.微生物技术的种类
微生物技术主要是利用微生物的代谢反应过程和生物合成产物(包括酶)对污染环境进行监测、评价、整治以及修复的单一或综合性的现代化人工技术系统。它不仅包含了生物技术所有的特点，还融合了环境污染防治以及其他工程技术，目前己逐渐发展成为一种经济效益和环境效益俱佳的、能解决日益严重的(尤其是水污染)环境问题的有效手段之一。。按照微生物的来源，主要分为接种微生物技术和培养土著微生物技术。
2.1接种微生物技术
这种技术适用于当水体中污染物的降解菌很少甚至没有，在现场富集培养降解菌存在一定难度时的情况。它是通过向水环境中引入菌种来实现的。。向水环境中引入的菌种既可以从待治理水体的土著微生物中富集而得，也可以从其它环境中分离得到，甚至可以使用基因工程菌。因此，按其来源可分为土著微生物、外来微生物和基因工程菌。CBS（集中式生物系统)，为美国CBS公司的科学家开发研制，并得到广泛应用。CBS系统是一个良性循环的微生物生态系统。含有多个属、几十种具备各种功能的微生物，主要包括光合菌、乳酸菌、放线菌，酵母菌等构成了功能强大的“菌团”。采用CBS治理重庆桃花溪河、成都府南河和重庆府川河都取得了很好的效果。例如，我们应用土著微生物培养液和BBL1菌液对富营养化人工景观湖水进行净化试验，分别考察了曝气、载体和底泥对净化效果的影响。试验结果表明，含有生物促生剂的土著微生物培养液和BBLI菌剂均能降低水中的CODMn、氨氮、总磷和浊度。在有载体的状态下，净化作用更为显著。底泥的存在强化了BBL1菌剂对氨氮的去除，去除率大于90%。又如，我们采用新型生物制剂Eclean治理北京动物园富营养化水体。试验结果表明，水体中的CODMn、TN、TP、浊度、叶绿素a和藻类浓度等各项指标均有明显下降，水质明显改善，藻类生长基本得到控制。应用优势菌剂处理城市湖泊水的试验表明，投加光合菌、硝化菌、复合菌的混合液对水中的浊度、叶绿素a有明显的去除效果，投菌后的第8d对浊度的去除率就达到了88%。水体中存在一些有益微生物菌群(EM菌)，包括光合细菌、硝化细菌、芽抱杆菌、乳酸菌、枯草杆菌、放线菌和酵母菌等，对污染水体的治理是非常有效的。在使用EM菌处理南水塘藻型富营养化源水的效果。在容器中按V(EM):V(源水)为1:10000的比例投加EM菌液并辅以低速间歇式曝气处理8d-9d，藻类生物量得到明显控制，叶绿素a、TN、TP及CODMn去除率分别达9.049%，45.25%，55.48%及8.237%，出水水质接近国家地表VI类水质标准。光合细菌可以通过光合作用，维持物质循环，降解废弃有毒物，起到净化水质的作用。例如从猪的污水池中分离得到一株紫色非硫菌株，此菌株通过光合作用能够使污水池中不稳定的有机化合物减少80%一93%，能够显著改善垃圾池的气味。
近年来，随着环境微生物技术的发展，基因工程菌(GEM)在污染水体的治理方面越发显示出优势。构建高效的基因工程菌可以显著提高污染物的降解效率。同时，环境微生物尤其是细菌中的污染物降解基因、降解途径等许多污染物降解机制的阐明为构建具有高效降解性能的污染物降解基因工程菌提供了可能。
2.2培养土著微生物技术
这是一种污染水体的微生物强化治理技术，它通过向水体中投加营养物质、无毒表面活性剂、电子受体或共代谢基质来激活水环境中本身具有降解污染物能力的微生物(即土著微生物)，充分发挥土著微生物对污染物的降解能力，从而达到水体修复的目的
2.2.1投加营养物(激活剂)
生物激活剂一般是由矿物质、有机酸、酶、维生素和营养物质混合而成的天然复合品。例如采用生物激活剂Bio oxidator TM(Bo)和Nutra complex TM(NC)对上海植物园兰室和牡丹园的湖水进行治理。这两种药剂主要含有生物刺激剂、酶、氨基酸、腐植酸和尿素等成分。结果表明，施用生物激活剂BO和NC对水体COD、BOD、TP和浊度等均有明显的去除效果，并可显著提升水体溶解氧。
2.2.2投加表面活性剂
由于表面活性剂可以改变有机污染物的某些性质，增加污染物与微生物细胞接触的几率，从而显著提高一些污染物的生物降解速度。近年对表面活性剂的研究有加强的趋势用吸附-浮选法去除工业废水中的Cr6+和Zn2+。。向废水投加针铁矿和氢氧化铁，吸附金属离子，然后用生物表面活性剂脂肽-105和地衣素-A作为浮选剂进行固液分离。加入表面活性剂可以减少吸附在非水相液体表面的细菌，使其在葱中生长。
2.2.3投加共代谢基质或电子受体
在污染水体的治理过程中，共代谢途径对于难降解有机物的生物降解也是非常重要的。在好氧条件下，利用葡萄糖诱导顺式1，2-二氯乙烯的生物降解，其降解效率、降解速率都明显高于厌氧条件，说明葡萄糖诱导的共代谢过程发挥了决定性的作用另外，也有研究表明，腐殖酸和醒类物质在有机物生物降解过程中，可起到电子受体的作用。在缺氧条件下，腐殖酸作为最终电子受体可作为三价铁的鳌合剂，从而提高铁离子的溶解度，强化水体底泥中苯的降解。
3.微生物技术的特点和优势
与物理和化学法相比，微生物技术具有一系列的特点和优势:(1)污染物的转化过程不需要高温、高压，在温和的条件下经过酶催化即可高效并相对彻底完成。处理费用低廉，仅为物理化学法的30%-50%。(2)微生物具有来源广、易培养、繁殖快、对环境适应性强和易实现变异等特性，适当地对其加以培养繁殖，特别是在一定条件下加以驯化，就能使之很好地适应各种有毒的工业废水、生活污水等环境。通过有针对性地对菌种进行筛选、培养和驯化，可以使大多数的有机物实现生物降解处理，应用面宽。(3)微生物处理不仅能去除有机物、病原体、有毒物质，还能去除臭味、提高透明度、降低色度等，处理效果良好。(4)对环境影响小，不产生二次污染，遗留问题少。(5)人类直接暴露在污染物下的机会减少。(6)就地处理，操作简便，可以避免铺设不雅观的机械设备。
4.微生物技术存在的问题
虽然微生物技术在污染水体的治理中取得了良好的应用效果，并具有广泛的应用前景，但在实际应用中还有许多问题有待解决。微生物技术一般在好氧条件下效果良好，在厌氧条件下效果往往不甚理想，如EM菌群在厌氧条件下对COD的去除不起促进作用;在重金属存在条件下，净水微生物制剂对水体中COD的去除率随着重金属浓度的升高而逐渐减少等等。微生物技术在污水治理上的不稳定性，一方面源于生活污水、工业废水成分更复杂，有机质种类及含量、微生物种群、溶氧条件、温度等千差万别，有毒有害物质如重金属离子、苯系化合物、氰化物、偶氮染料等较多，另一方面缺少理论研究和指导，尤其是应用生态学方面研究少。因此，研究人工投放的微生物在水体中的存活状态、作用状态、与土著微生物的相互作用关系等将有助于阐明微生物技术在污水治理上的应用前景，并为进一步的有效应用提供指导。
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[关键词]食品微生物；快速检测；食品安全
随着人们生活水平的不断提高以及公民安全意识的不断增强，食品安全问题越来越多的受到人们的关注和重视。食源性微生物造成的食品安全问题是目前食品安全之中最严重、最突出的问题，它给人类身体健康和食品安全带来了不容忽视的威胁。食品微生物快速检测技术具有简便、快捷、准确、灵敏等特点，因此得到了越来越广泛的应用和推广。
1.免疫学技术
第一，免疫荧光技术，又被称为荧光抗体技术。这一技术通过抗原抗体反应的特异性，使用荧光色素进行标记，使被检测的样本与对应的抗原或者抗体结合，然后再进行洗涤将位于载体表面的抗原抗体分离，之后再加入一定量的酶反应底物，最终在较短时间内就可以根据有色产物的深浅及多少来实现对检测样本的定量分析。第二，免疫层析技术，这是一种固相免疫测定技术。这一食品微生物快速检测技术通过样品中的物质在膜的毛细血管作用下产生分离，某些抗原抗体在相互结合过程中被固相化，除了标记物之外的物质就会被分离出来。我国目前应用较为广泛的是胶体金免疫层技术，通常在食品中霍乱弧菌、金黄色葡萄糖球菌、大肠杆菌等的检测鉴定中运用。
2.分子生物学
目前较为广泛应用的分子生物学食品快速检测技术主要有基因芯片技术和基因探针技术。首先，基因芯片技术是指通过微电子技术和分子生物学技术的应用使得被标记的基因探针与核苷酸点进行杂交，从而区分不同的细菌，实现对检测样本中微生物的快速检测和鉴定。这种方法是一种高通量的核酸分子杂交技术，可以在较短时间内准确的对上千基因进行分析，检测出样本中的所有潜在病因以及遗传性指标。其次基因探针技术是指通过对检测样品以及DNA探针进行检测，观察是否有稳定的杂交分子出现，然后判断是否有某种微生物的存在。这种技术可以与DNA指纹图谱自动分析系统结合进行应用，可以更加简单快捷的实现食品中微生物的定量分析与研究。
3.ATP生物荧光技术
ATP是一种高能磷酸化合物，含量相对稳定，普遍存在于各种细菌细胞中，并且是所有生物生命活动的最终能量来源。ATP生物荧光技术的原理是荧光素在荧光素酶的催化作用下，通过ATP的激活使之与氧进行结合，从而将化学能转化为光能，即释放出光量子。通过ATP不断提供能量，荧光分子不断被激活，即ATP的浓度与发光强度呈线性关系。ATP 生物荧光技术不需要进行微生物的培养，可以在几分钟内得到检测结果，目前普遍应用于肉制品杂菌污染鉴定、饮料中的微生物测定、调味品的微生物检测等。除此之外，选取合适的ATP 提取剂能够降低外界干扰，增强对微生物的特异性识别，最终提高检测灵敏度和检测效率。
4.PCR技术
PCR技术是指聚合酶链式反应，是一项DNA的体外快速扩增技术。PCR技术通过将具有特异性的DNA进行大量的体外复制并进行检测分析，如果存在目的菌就将相关的DNA复制出来进行聚合酶链式反应。PCR技术具有操作简便、检测快速、敏感性高以及污染程度小等优点，因此现在已经广泛应用于食品微生物的快速检测。PCR技术可以实现在一个反应体系中同时对多个目标序列的荧光检测，不但节约了时间、人力和财力，同时又避免了污染，节约了检测成本，有效的提高了食品微生物快速检测的效率。
5.干片法
干片法是指通过培养无毒的高分子材料作为培养基载体从而实现对食品中微生物的定量检测分析。这是一种结合微生物学、高分子学以及化学综合应用的常规检测方法，检测过程中不需要进行实际的配置，不但保证了测定结果的准确性，还具有操作简单、成本较低以及携带方便等优点。除此之外，干片法减少了化学医疗废弃物的产生，减少了环境污染，在一定程度上减少了人力、财力的投入，从而保证了检测的质量。
6.发展前景
食品安全问题关系到人民身体健康和国际民生，因此备受各国人民的关注和重视。各种不同的微生物快速检测技术具有十分明显的优点，但是各种食品中存在的阻碍因素使得检测过程中存在一定的困难和挑战。现展的微生物快速发展技术实现了快速、灵敏、准确的检测过程。由此可见，我国今后食品微生物快速检测技术具有十分良好的发展前景。食品微生物快速检测技术将向着自动化、快速化、灵敏度高、特异性强、操作简单的方向发展，从而使得食品微生物快速检测技术随着经济社会的不断发展而不断进步。另一方面随着科学技术的不断发展和进步，越来越多更加简单快捷的微生物检测方法和检测体系将会出现，更多快速、简便、特异的检测技术将得到更加广泛的推广和应用，从而满足人们对食品安全的更高要求，为人类生活营造更加健康的生活环境。
7.小结
由此可见， 食品微生物快速检测技术具有很多优点，因此得到了人们越来越多的关注和应用，从而推动了我国微生物快速检测技术的发展和进步。因此检测机构要不断完善食品微生物快速检测技术研究体系，不断提高检测队伍的自身实力，保证检测技术和检测设备的先进性，确保检测过程中可以做到成本最低的同时实现快速检测鉴定的准确性和有效性。
[参考文献]
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