时间：2023-02-22 04:34:47
【摘要】
目的: 制备抗人11β羟类固醇脱氢酶1（homo sapiens hydroxysteroid 11beta dehydrogenase 1， HSD11B1）的单克隆抗体（mAb）并初步鉴定其特性。方法: 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体， 用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠， 采用杂交瘤技术制备mAb， 并通过间接ELISA法、 Western blot、 免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定， 通过免疫沉淀、 UniZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原。结果: 通过间接ELISA筛选获得1株可稳定分泌抗人HSD11B1 mAb的杂交瘤细胞系。其分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG1（κ）， Western blot 结果显示该mAb可以特异地识别相对分子质量(Mr)为35000的蛋白; 应用mAb CBF245对人肝脏cDNA表达文库（UniZAP XR）进行筛选， 阳性噬菌斑测序结果显示5个阳性克隆插入序列均为HSD11B1。结论: mAb BAD062特异地识别抗原HSD11B1， 该mAb可用于ELISA检测、 Western blot、 免疫组化和免疫沉淀实验， 为HSD11B1的研究提供了有力的工具。
【关键词】 HSD11B1 单克隆抗体 线粒体
[Abstract] AIM: To generate and identify monoclonal antibodies (mAb) against homo sapiens hydroxysteroid 11beta dehydrogenase 1 (HSD11B1). METHODS: Normal human liver tissues were homogenized， and mitochondria were isolated by differential centrifugation. The total mitochondrial proteins were used to immunize BALB/c mice to generate mAb by hybridoma technique. The mAb were characterized by ELISA， Western blot and immunohistochemistry. The antibody specificity was identified by immunoprecipitation (IP)， and confirmed by UniZAP expression library screening. RESULTS: One hybridoma CBF245 secreting specific mAb against HSD11B1 was established. The Ig subclass of this mAb was IgG1， and it could be used in ELISA， Western blot， immunohistochemistry. Our data showed that the antigen recognized by CBF245 mAb was localized in the hepatocyte cytoplasm， with molecular weight of Mr 35 000 in the mitochondria of human liver tissue. The CBF245 mAb was further confirmed by immunoscreening of UniZAP XR liver cDNA expression library. CONCLUSION: A hybridoma cell line stably secreting specific mAb against HSD11B1 is established and characterized. This mAb reacted with HSD11B1 in ELISA， Western blot， immunohistochemistry assay， IP， and would be very useful for the HSD11B1 studies.
[Keywords]HSD11B1; mAb; mitochondria
11β羟类固醇脱氢酶1（homo sapiens hydroxysteroid 11beta dehydrogenase 1， HSD11B1）属于短链脱氢/还原酶蛋白超家族(SDR)， 为相对分子质量(Mr)为34000的糖蛋白。此酶主要以糖基化的形式存在于微粒体， 其作用依赖于辅酶NADP， 在体内负责活性的糖皮质激素向其无活性前体的转换， 调节局部糖皮质激素浓度， 并决定糖皮质激素流向其受体[1]。代谢综合征糖皮质激素敏感性增加， HSD11B1调节异常， 可能是肥胖、 糖耐量低减、 高血压和心血管疾病等代谢综合征重要发病机制之一， 选择性HSD11B1抑制剂有望成为其治疗靶点。HSD11B1在体内广泛表达， 多分布于肝、 肺、 脂肪组织、 脉管系统、 卵巢及中枢神经系统。我们在成人肝脏线粒体单克隆抗体(mAb)库的建立中， 应用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠制备mAb， 其中1株为鼠抗人HSD11B1 mAb， 并对其特异性进行了鉴定， 为进一步研究HSD11B1的作用奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料 免疫和筛选用成人肝组织线粒体总蛋白， 由本室制备; 弗氏佐剂为Sigma公司产品; 羊抗鼠IgGHRP为中山公司产品; 蛋白酶抑制剂为Roche公司产品; BCA蛋白定量试剂盒为Pierce公司产品; cDNA 表达文库为美国Stratagene公司产品; PVDF膜、 ECL反应试剂盒均为Amersham公司产品; DY89Ⅱ型电动玻璃匀浆机构自宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备 成人肝组织匀浆700～750 r/min， 10 g组织加40 mL匀浆缓冲液800 g离心10 min， 取上清， 10000 g离心10 min， 沉淀即为线粒体， 用匀浆缓冲液洗2次[2]。用RIPA裂解液裂解线粒体样品， 离心后取上清， 获得线粒体总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度， 计算线粒体的得率， 通过测定匀浆液和分离的线粒体中的琥珀酸脱氢酶的活性计算线粒体的富集度， SDSPAGE鉴定抗原的Mr。
1.2.2 鼠抗人mAb的制备 首次免疫免将线粒体总蛋白1 mg与等体积弗氏完全佐剂混合后进行充分乳化， 多点皮下注射。首次免疫后4周加强免疫1次， 1周后经尾静脉取血， 分离血清， ELISA法包被线粒体总蛋白10 μg/L测定效价。融合前3 d进行加强免疫， 取小鼠脾细胞与X653细胞进行细胞融合， 采用杂交瘤技术制备mAb。
1.2.3 抗体识别抗原的鉴定 （1）免疫沉淀: 应用CBF245 mAb从线粒体总蛋白中免疫沉淀相应的抗原， 进一步还原SDSPAGE电泳， 电转至PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h， 然后加入1∶2000稀释的mAb， 室温下孵育2 h（或4℃过夜）， TBST缓冲液洗膜后， 加入羊抗鼠IgGHRP抗体（1∶5000稀释）， 室温下孵育1 h， TBST缓冲液洗膜后， ECL法显色。（2）抗原的UniZAP XR人肝脏cDNA表达文库筛选: 取大肠杆菌XL1BLUE MRF’过夜培养菌接种于LB培养液中， 37℃震荡培养至A600为0.7左右， 3000 r/min下离心10 min， 用10 mmol/L的硫酸镁重悬细菌沉淀至A600为0.5， 取适当稀释的文库60 μL（含约50000个噬菌体）与600 μL重悬的XL1BLUE MRF’混匀后37℃温育20 min， 铺至150 mm的NZYLB平板上， 42℃倒置培养至噬菌斑模糊可见， 将浸泡过IPTG的NC膜覆盖表面， 37℃继续培养3.5 h， 用防水墨水定位后， 剥离滤膜， 进行常规Dot blot检测。在原位板上回收阳性克隆， 用ExAssist辅助噬菌体进行体内剪切、 测序及Western blot分析。
1.2.4 mAb的鉴定 （1）Western blot分析: 线粒体总蛋白经还原SDSPAGE后， 电转至PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h， 然后加入1∶2000稀释的mAb， 室温下孵育2 h（或4℃过夜）， TBST缓冲液洗膜后， 加入羊抗鼠IgGHRP抗体（1∶5000稀释）， 室温下孵育1 h， TBST缓冲液洗膜后， ECL法显色。（2）免疫组化鉴定: 用丙酮固定的冰冻成人肝组织切片， PBST浸洗5 min后每个组织片滴加25 mg/L的Avidin 50 μL， 室温孵育15 min， 滴加30 mL/L H2O2－甲醇， 室温孵育15 min。滴加正常羊血清室温下封闭30 min， 加入1∶100稀释的鼠抗人HSD11B1 mAb， 4℃孵育过夜。PBS洗片后加入羊抗鼠IgGHRP， 37℃孵育30 min， PBS洗片后进行DAB显色， 苏木素复染， 返蓝后封片。
2 结果
2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备 通过差速离心方法分离线粒体， 每克肝组织可得到8～10 mg线粒体蛋白。通过测定琥珀酸脱氢酶活性并计算线粒体富集度， 多次结果显示为线粒体富集度为4～7倍， 成人肝组织线粒体总蛋白经还原SDSPAGE， 显示其Mr主要分布在25000～75000之间（图1）， 与文献报道一致[3]， 可作为免疫动物的抗原。
2.2 鼠抗人mAb的制备及初步鉴定 应用细胞融合、 筛选和克隆化， 获得1株抗人肝脏线粒体阳性的细胞株CBF245， 其亚类（型）为IgG1（κ）。
2.3 抗体识别抗原的鉴定 （1）抗原的免疫沉淀鉴定（图2）: 泳道1用正常鼠血清免疫沉淀线粒体作为阴性对照， 泳道2为CBF245免疫沉淀线粒体的结果。Western blot和IP结果显示， CBF245特异识别成人肝线粒体组织中Mr为35000的蛋白（箭头所示）， 泳道1和2中鼠mAb重链亦可见显色。（2）抗原的UniZAP XR人肝脏cDAN表达文库筛选: 用CBF245的杂交瘤细胞培养上清对UniZAP XR人肝脏cDNA表达文库进行第1轮筛选， 铺板密度为50000个噬菌体/150 mm平板， 以保证在一张NC膜上尽可能多的增加免疫筛选的噬菌斑数， 经过第1轮筛选， 共得到了5个强阳性噬菌斑（图3A）， 挖取此5个阳性噬菌斑混合后进行第2轮筛选， 铺板密度为1000个噬菌体/150 mm平板， 以获得可以分离的独立克隆。经第2轮筛选后， 阳性噬菌体得到大大的富集， 得到了单克隆的阳性噬菌斑15个（图3B）。分离其中的5个独立的阳性克隆进行体内剪切并转入大肠杆菌中， 并进行诱导表达， 测序。测序结果进行Blast比对。结果显示5个克隆测序结果一致， 阳性克隆插入基因起始位置为HSD11B1的前导肽， 距起始密码子ATG 39 bp， 因此CBF245识别的抗原为HSD11B1。
图1 成人肝组织线粒体总蛋白SDSPAGE电泳（略）
Fig 1 SDSPAGE analysis of human liver mitochondrial total lysates
M1: Protein marker; 1: Mitochondrial total lysates.
图2 CBF245 mAb的Western blot分析（略）
Fig 2 Western blot analysis of CBF245 mAb
M2: Mitochondrial proteins immunoprecipitated by normal mouse IgG; 2: Mitochondrial proteins immunoprecipitated by CBF245 (Primary antibody: CBF245).
图3 抗体CBF245的UniZAP XR表达文库的筛选（略）
Fig 3 Antibody screening of fusion proteins expressed in lambda UniZAP XR human liver expression cDNA library
A: The first cycle of screening; B: The second cycle of screening.
2.4 抗体的特异性鉴定 （1）mAb的Western blot检测: 正常成人肝组织线粒体总蛋白作为抗原进行Western blot鉴定。泳道1以正常鼠血清为一抗， 作为实验的阴性对照， 泳道2以分泌抗人HSD11B1抗体的杂交瘤细胞株CBF245的细胞培养上清作为一抗。Western blot结果显示， CBF245能特异识别成人肝胞质总蛋白中Mr约为35000的蛋白（图4）。（2）mAb的免疫组化鉴定: 免疫组化结果显示， 鼠抗人HSD11B1 mAb识别的抗原定位于成人肝组织肝细胞胞质（图5）。
图4 CBF245 mAb的Western blot分析（略）
Fig 4 Western blot analysis of CBF245 mAb
1: Primary antibody; Normal mouse IgG; 2: Primary antibody; CBF245.
图5 HSD11B1 mAb的免疫组化鉴定（略）
Fig 5 ImmunohistochemistryidentificationformAbagainstHSD11B1
A: Negative control; B: Localization of HSD11B1 in human liver tissue.
3 讨论
代谢综合征是高血压、 血糖异常、 血脂紊乱和肥胖症等多种疾病在人体内集结的一种状态。HSD11B1能增强糖皮质激素的活性， 糖皮质激素通过使糖异生的限速酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)表达上调， 对抗胰岛素活性， 抑制胰岛β细胞的分泌[4]; 糖皮质激素亦能增加脂肪细胞内脂肪生成和脂质合成代谢， 研究发现， HSD11B1转基因小鼠显示内脏脂肪组织肥厚[5]; 此外， HSD11B1可以通过增加肝脏血管紧张素原的表达来影响血压， 进一步的研究显示在脂肪组织中过多表达的HSD11B1影响肾素血管紧张素醛固酮系统而导致血压增高。综上所述， HSD11B1参与了胰岛素抵抗、 肥胖、 2型糖尿病、 高血压在内的代谢综合征的病理生理环节， 为临床研究提供了可喜的前景， 可通过选择性抑制HSD11B1的活性， 降低肝脏内和脂肪组织的氢化可的松浓度， 减少肝糖异生， 提高组织对胰岛素的敏感性， 为糖尿病及代谢综合征的研究和治疗提供新的靶点[6]。
我们采用正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体总蛋白， 用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠， 采用杂交瘤技术制备得到了一株抗HSD11B1的杂交瘤细胞株CBF245， 此mAb可应用于ELISA、 免疫组化和免疫沉淀实验， 为将来筛选表达HSD11B1的细胞和（或）组织、 HSD11B1的组织及细胞定位、 寻找与HSD11B1相互作用的分子提供了有力的工具。
参考文献
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【关键词】 mBD2;，真核表达;，免疫荧光;，RT
Cloning and eukaryotic expression of murine betadefensin2(mBD2)
[Abstract] AIM: To clone murine beta defensin2 gene (mBD2) and to express the mBD2 protein eukaryotically. METHODS: Total RNA was isolated from the lungs of BALB/c mice which were injected with LPS in advance. The DNA fragment encoding mBD2 was amplified by RTPCR and inserted into the plasmid pcDNA31(+)， which was then digested with EcoRⅠand Xho I to construct the recombinant plasmid， pcDNA31(+)/mBD2. The pcDNA31(+)/mBD2 was identified by endonuclease digestion， PCR， and sequencing analysis. The SiHa cells were transfected with pcDNA31(+)/mBD2 plasmid and screened by G418 of 100 mg/L over 20 days. Steady expression of mBD2 was confirmed by immunofluorescent staining and RTPCR. RESULTS: About 250 bp DNA fragment was amplified by RTPCR from lung total RNA of the mice injected with LPS. The eukaryotic expression vector， pcDNA3.1(+)/mBD2， was successfully constructed after inserting the mBD2 fragment into pcDNA31(+). Most of SiHa cells transfected with pcDNA31(+)/mBD2 and screened by G418 could express the mBD2 protein， confirmed by immunofluorescent staining and RTPCR. CONCLUSION: The eukaryotic vector of pcDNA31(+)/mBD2 was successfully constructed and transfected into SiHa cells， which established a solid foundation for further study on the biological characteristics and antitumor mechanisms of the mBD2 protein.
[Keywords]murine betadefensin2; eukaryotic expression; immunofluorescence; RTPCR
[摘 要] 目的: 对小鼠β防御素2（mBD2）基因进行克隆， 构建其真核表达载体， 筛选出稳定表达细胞株， 并研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤机制。方法: 通过向BALB/c小鼠腹腔注射内毒素(LPS)， 建立小鼠急性时相反应， 取其肺组织提取总RNA， 采用RTPCR方法扩增小鼠mBD2基因， 经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pcDNA3.1（+）真核表达载体， 对其进行酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2转染SiHa细胞， 采用G418进行稳定表达株的筛选， 用免疫荧光染色和RTPCR鉴定细胞内mBD2蛋白表达情况。结果: 提取小鼠肺组织总RNA， 采用RTPCR方法扩增了250 bp左右的产物， 通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切， 构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2。SiHa被该质粒转染后， 在100 mg/L G418浓度下筛选20 d， 得到了稳定表达mBD2的细胞株， 用免疫荧光染色显示mBD2蛋白在胞质中有大量表达， RTPCR反应扩增到了mBD2的mRNA。结论: 成功地构建了pcDNA3.1(+)/mBD2真核表达质粒， mBD2蛋白在SiHa细胞中能稳定表达， 这些结果为进一步深入研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤的作用奠定了基础。
[关键词]mBD2; 真核表达; 免疫荧光; RTPCR
抗菌肽是天然免疫的重要介质， 具有广泛的抗菌和抗病毒活性， 是机体防御感染的重要因素。防御素是最早发现的抗菌肽之一， 分为4个类型: α防御素、 β防御素、 植物防御素和昆虫防御素[1]。其中， β防御素在组织中的表达具有特异性， 在局部黏膜免疫中起重要作用。鼠β防御素（murine beta defensin， mBD）2和3可以趋化未成熟的树突状细胞（DC）及CCR6转染的HEK293细胞[2]。采用DNA疫苗的研究方法也证明了mBD参与了获得性免疫应答。已有的研究还发现， mBD对大多数带负电荷的真菌、 支原体、 螺旋体等致病微生物均有攻击作用。高等动物的细胞由于存在高度发达的细胞骨架系统，
且细胞膜中负电荷较低而免受攻击。癌细胞由于生长旺盛故细胞骨架系统不发达， 这可能是防御素对癌细胞具有抑制作用的原因之一[3]。我们通过构建mBD2真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2， 将其转染HPV16（+）宫颈癌细胞株SiHa细胞， 并对转染细胞进行稳定筛选及分析鉴定蛋白的表达， 为研究mBD2蛋白在抗宫颈癌中的作用机制研究奠定细胞学基础。
1 材料和方法
1.1 材料 选用4周龄BALB/c小鼠， 由四川大学华西医学实验动物中心提供。真核表达质粒pcDNA3.1(+)为本室保存， SiHa细胞株由四川大学华西医学中心免疫学教研室魏大鹏老师惠赠， 用RPMI1640细胞培养基（GIBCO公司产品）、 50 mL/L CO2条件下进行培养。LPS为Sigma公司产品， TRIZOL由Invitroge公司生产， 两步法RTPCR试剂盒为Fermentas公司产品， Premix Taq购自Takara公司， 胶回收试剂盒购自Omega 公司的E.Z.N.A GEL cycle Kit， 质粒提取使用Omega公司的E.Z.N.A Plasmid Mininprep KitⅠ。T4 DNA连接酶和限制性内切酶EcoRⅠ、 XhoⅠ均为Fermentas公司产品。引物合成由上海Invitroge公司完成。羊抗鼠mBD2抗体购自Santa cruz 公司， 荧光标记的兔抗羊IgG抗体、 辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG抗体和封闭用兔血清均购自Fermentas公司， DAB显色试剂盒为中杉金桥公司产品， 真核转染试剂Lipofectamine购自Invitrogen公司。凝胶成像仪和Gelpro analyzer 4.0软件购自Media Cybernetics(USA).
1.2 方法
1.2.1 mBD2总RNA的提取及cDNA合成 以50 mg/g的剂量给BALB/c小鼠腹腔注射LPS， 12 h后颈脱臼处死小鼠， 无菌条件下分离小鼠肺组织， 提取肺组织总RNA[4]。取1 mL总RNA进行反转录，
反应条件为60℃ 5 min， 42℃ 60 min， 85℃ 2 min。RT过程中采用oligo(dT)引物进行反转录获得cDNA， 以备PCR产物的合成。
1.2.2 PCR反应 根据GenBank中查得的mBD2基因序列(基因登陆号AJ011800)设计扩增mBD2基因的引物， 上游引物为(下划线为酶切位点): ACGAATTCGAGTGCCCTTTCTACCAG（EcoRⅠ）， 下游引物为: CTCTCGAGACTTCCATGTGCTTCCTT（XhoⅠ）扩增产物长度为257 bp， 其中34~244 bp处为mBD2全基因序列。PCR反应条件为: 94℃预变性4 min， 94℃变性30 s， 54℃退火35 s， 72℃延伸30 s， 30个循环后72℃ 10 min终止反应。同时设立小鼠βactin基因作为扩增反应阳性对照， 其上游引物为: CCATGGATGACGATATCGCTGC， 下游引物为: GCTTCTCTTTGATGTCACGCACG， 扩增片段长度为669 bp。
1.2.3 mBD2真核表达质粒的构建与鉴定 对PCR产物和pcDNA3.1(+)质粒DNA分别采用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收目的片段， 经T4 DNA连接酶在16℃将mBD2基因插入pcDNA3.1(+)质粒。连接产物转化JM109感受态细胞， 挑取Amp筛选的阳性克隆并采用PCR及EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定， 最后将PCR及双酶切鉴定正确的质粒送上海Invitroge公司测序， 并分析克隆基因序列组成及其阅读框架的正确性[5]。取构建正确的pcDNA3.1(+)/mBD2质粒转染SiHa细胞株。
1.2.4 细胞培养及mBD2稳定表达株的筛选 SiHa细胞株于37℃、 50 mL/L CO2条件下在含有150 mL/L小牛血清、 100 mg/L青霉素及1×104U/L链霉素的RPMI1640培养基中进行培养。将生长良好的细胞用上述完全培养基调至2×108~5×108/L后按2 mL/孔分装至6孔板中， 待细胞贴壁生长至大约70%覆盖密度时进行转染。转染采用Lipofectamine试剂， 按pcDNA3.1(+)/mBD2 DNA 4 μg/孔、 转染试剂10 μL/孔对细胞进行转染， 同时设立空白质粒对照及不进行转染的对照孔。转染48 h后采用100 mg/L浓度进行G418稳定筛选[6]， 在G418筛选20 d后挑选单克隆进行扩增， 用间接免疫荧光染色法对细胞内目的蛋白表达情况进行鉴定， 并在稳定筛选后4、 6、 8、 10周提取细胞总RNA， 采用RTPCR测定mBD2 mRNA的表达。
1.2.5 间接免疫荧光染色 将稳定筛选出的细胞于6孔板中进行细胞爬片培养， 24 h后用PBS洗6孔板3次， 每次2 min。加入4 mL/L多聚甲醛2 mL/孔， 室温固定30 min。洗板， 加入5 mL/L的Triton100 2 mL/孔， 室温放置30 min。洗板， 加入正常封闭兔血清20 mL/孔， 室温封闭30 min。加入1∶500稀释的羊抗鼠mBD2抗体， 4℃过夜。洗板， 加入1∶50稀释的荧光素标记的兔抗羊IgG抗体， 室温放置30 min。洗板， 风干后用500 mL/L的甘油封片。倒置荧光显微镜观察并记录细胞内mBD2蛋白表达情况并荧光照相记录实验结果。
1.2.6 mBD2蛋白稳定表达的RTPCR鉴定 采用RTPCR方法考察稳定转染的SiHa细胞中mBD2的mRNA表达情况， 方法同前。
2 结果
2.1 mBD2真核质粒的构建及鉴定 BALB/c小鼠经腹腔注射LPS后12 h， 分离小鼠肺组织， 提取到符合要求的肺组织总RNA。以该总RNA作为模板， 经过RTPCR扩增得到了大约250 bp左右的基因片段（图1）， 而βactin同样扩出了大约670 bp左右的条带。将该片段用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后与同样经双酶切的质粒pcDNA3.1（+）载体连接， 连接产物经转化大肠杆菌JM109， Amp筛选出阳性克隆。重组质粒DNA经双酶切鉴定， 20 g/L琼脂糖凝胶电泳显示获得250 bp的插入片段（图2）。测序结果表明所构建的真核表达质粒不仅含有完整的mBD2基因全序列， 而且阅读框架也正确无误， 与设计的基因序列完全一致， 无碱基突变。
图1 小鼠mBD2 PCR扩增产物 略
图2 重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD2酶切鉴定 略
2.2 真核转染及稳定表达株的筛选 在6孔板中采用pcDNA3.1(+)/mBD2质粒对SiHa细胞进行转染之后， 48 h后在培养基中加入G418进行稳定筛选， 20 d后挑取单克隆转入细胞培养瓶中进行克隆扩增培养， 获得稳定表达株。
2.3 稳定表达株的间接免疫荧光染色鉴定 间接免疫荧光染色后观察显示， 转染pcDNA3.1(+)/mBD2细胞胞质内存在mBD2蛋白表达（图3A）， 而转染pcDNA3.1(+)及未转染质粒的SiHa细胞在间接免疫荧光实验中均未观察到细胞内绿色荧光存在（图3B、 C）。
图3 mBD2蛋白在pcDNA3.1(+)/mBD2、 pcDNA3.1(+)转染SiHa细胞和对照细胞中的稳定表达 略
2.4 稳定表达株的RTPCR鉴定 对稳定稳筛4、 6、 8、 10周细胞株进行总RNA提取， 电泳可见3条明显的RNA条带。RTPCR反应中， 四个时间点的mBD2特异性引物PCR扩增同样得到了250 bp左右大小的目的片段， 证实稳定筛选得到的SiHa细胞株中有mBD2基因表达的mRNA， 与前述试验中提取的mBD2基因完全一致， 目的基因稳定表达。
3 讨论
1986年， Lichtenstern等[7]在鼠恶性畸胎瘤中首先发现了防御素对肿瘤细胞的裂解作用，提出了防御素参与肿瘤免疫的理论。将mBD2和mBD3的基因与B细胞淋巴瘤的表位（淋巴瘤特异性可变区重链VH 和轻链VL 片段）基因融合作为DNA疫苗免疫小鼠， 不仅使小鼠对非免疫原B细胞淋巴瘤抗原产生有效的体液免疫应答， 而且还能提高B细胞淋巴瘤小鼠抗肿瘤免疫的能力， 而这种模型鼠的抗肿瘤保护作用依赖于肿瘤特异性细胞免疫的产生[2]。目前对防御素参与肿瘤免疫的机制还不是很清楚， 主要集中于在作为内源性TOLL样受体4（TOLLlike Receptor 4， TLR4）的配体， 与肿瘤抗原结合， 刺激DC的成熟， 从而增强机体的细胞免疫，发挥抗肿瘤作用[8-10]。本研究致力于研究女性高发肿瘤宫颈癌， 试图将mBD2转染HPV16（+）的SiHa细胞， 通过稳定筛选获得稳定表达mBD2的细胞株， 以便今后经一步探讨mBD2蛋白在宫颈癌中的保护作用。防御素基因的表达方式有两种: 组成式表达和诱导式表达。哺乳动物防御素和植物防御素的表达包括这两种方式， 而昆虫防御素的表达只能在微生物入侵或引起发炎、 感染的诱导剂存在下， 才能诱导表达。正常情况下mBD3主要表达于黏膜组织的上皮细胞中， 在其他组织中因检测方法不同而出现微弱表达或者不表达[11] 。mBD2产生主要为诱导表达[12]。建立急性时相反应时内毒素剂量的选取与实验动物的品系、 内毒素的来源和纯度有关， 我们采用BABL/c小鼠腹腔注射高纯度的内毒素（LPS）， 分别提取肝、 脾、 肺及肾组织总RAN， 采用RTPCR方法克隆mBD2的全基因序列。通过实验证实， mBD2的诱导表达部位主要在肺组织及肾组织， 而在脾脏和肝组织表达很少。此外， 也有文献报道采用内毒素诱导从皮肤组织提取RAN， 扩增mBD2的基因[8]。本研究中选用的真核表达质粒pcDNA3.1(+)， 由于它具有含有T7启动子， 便重组质粒的测序， 同时带有his标签， 可以用于真核细胞表达蛋白的分离及纯化。质粒序列中含有neo基因， 可被整合到细胞基因组中， 从而使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长， 并且能够表达外源DNA的特性， 因此可用于细胞转染后的稳定筛选。实验中我们将mBD2插入真核表达载体pcDNA3.1(+)， 构建pcDNA3.1(+)/mBD2真核表达质粒， 并将其转染HPV16（+）的宫颈癌细胞株SiHa细胞， 通过G418的稳定筛选， 获得了稳定表达细胞株， 通过免疫荧光染色证实该蛋白的表达主要存在于细胞质及细胞膜表面， 同时对稳定筛选后不同时间点细胞的RTPCR证实了该mRNA的持续表达。我们建立的mBD2稳定表达细胞株为今后进一步研究防御素的抗肿瘤的免疫机制奠定了细胞学基础。
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中图分类号：R446.6 文献标识码：B 文章编号：1005-0515（2011）3-308-01
我院2009年3月-2010年9月对80例自身免疫病患者进行抗核抗体(ANA)检测，结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 检测对象 80例患者均为我院风湿科、肾病科、皮肤科住院及门诊确诊患者.男30例,女50例,年龄32-65岁,平均41.6岁.其中系统性红斑狼疮(SLE)35例,类风湿性关节炎(RA)20例,肾病综合征11例,硬皮病6例,皮肌炎4例,干燥综合征4例。
1.2 检测方法 ANA测定采用间接免疫荧光法(IIF),试剂盒系欧蒙试验免疫制品,各项操作严格按照说明书进行,使用各种试剂均在有效期内。
1.3统计学方法 率的比较采用x2检验,检验水准α=0.05。
2 结果
80例不同病种ANA检测结果见表1，ANA分行结果见表2。
3 讨论
风湿性疾病是一种自身免疫性疾病，该病早期诊断困难，而早期又是该病发展最快的阶段，易造成骨质破坏，导致晚期患者严重残疾，故早期诊断和治疗甚为重要。自身抗体的检测可为其早期诊断提供重要依据，并为其发病机制提出新的探索性的见解。
注：与本病种组内其他核型比较*P＜0.05
ANA实际上是一个谱系，是一系列抗细胞核内和细胞浆内抗原成份的抗体总称，也是一组以真核细胞的各种细胞核作为靶抗原的自身抗体的总称。ANA的性质主要是IgG、IgM、IgA和IgD，且无器官特异性，故该类抗体可与所有动物的细胞核发生反应。ANA主要存在于血清中，也可存在于胸腔积液、关节腔积液和尿液中。有文献报道[1]，正常老年人也可出现低度的ANA。ANA阳性者并不一定患有自身免疫性疾病。间接免疫荧光法检测ANA公推为“金标准”是常用的筛查性项目，荧光图形于抗体所作用的抗原成分有关，可根据发光图形大致判断患者自身抗体的种类。我们观察的6种自身免疫性疾病患者80例，均不同程度地检出了ANA。我们的研究资料表明各核型ANA在不同的自身免疫性疾病中出现不同组合，可行成各种疾病或疾病群的特征性抗体谱。我们的观察结果于文献报道[2]基本一致。因此，总ANA的检测在临床诊断和鉴别诊断中是一个极为重要的筛选试验，ANA阳性应进一步检测各类亚ANA抗体，这对明确诊断、临床分型、病情观察、预后及治疗评价都有重要意义。但我们认为，ANA滴度结果应结合临床表现及其他方面的实验室检查结果综合判断，以防漏诊误诊。
参考文献
我校在充分调研国内外“以器官系统为中心”教学改革后，于2010年开始启动“器官系统为中心”的教学改革，于2011年起正式实施，根据学生自愿和考核的原则，在五年制本科临床医学专业中遴选学生42人单列“卓越医师班”，尝试“以器官系统为中心”的教学改革，本文以免疫系统功能与疾病为例，总结以结构功能与疾病模式进行课程整合的优点，分析存在的问题，以期将"以器官系统为中心"的教学模式进一步完善和发展。
1“以器官系统为中心”教学模式优势
1.1充分整合学习资源，有利于临床医专业学生培养 "以器官系统为中心"的教学模式，以疾病为中心，以器官系统为模块，整合临床和基础课程，系统讲述各器官系统正常结构与功能、病理生理、药理、疾病诊断与治疗。使医学生在结束学习后，能对整个器官系统的知识有系统了解，更适合医学生临床思维的培养[3-5]。
1.2减少各学科知识的重复，增加学习效率 传统的教学模式，各学科间内容重复较多，基础理论与临床脱节。以免疫系统课程为例，传统教学模式下，基础知识分散在《解剖组胚学》、《病理生理学》、《医学免疫学》等课程，免疫系统相关疾病分散在《内科学》、《神经病学》、《皮肤病学》、《外科学》、《儿科学》等课程，时间跨度在一年级至到四年级。各学科知识内容难免重复讲授，导致学生压力较大、容易遗忘，效率不高。而"以器官系统为巾心"的新型教学模式，能系统学习免疫系统结构、功能、相关疾病的诊断与治疗等内容，将免疫基础和临床紧密结合，培养学生主动思考和临床辩证思维的能力，加强学生对免疫系统疾病的临床表现、诊断和鉴别诊断以及治疗方法等的认识[3-5]。
1.3提高学习兴趣，培养综合能力 “以器官系统为中心”的新型教学模式是以培养其有更科学更完整知识体系、更高临床技能的医学生为目标。本课程在学习《医学免疫学》前提下，学习免疫系统组织学、免疫性疾病的病因与发病机制，实现了宏观和微观的统一；马上又进入到免疫性疾病的临床诊断基础，学习免疫系统疾病（重点在系统自身免疫性疾病和免疫缺陷病）的体格检查、病理检查、实验室检查和影像学检查等内容；接着学习常见疾病的诊断与治疗。
2 目前存在的问题及需要的改革
以“器官系统为中心”的教学模式尚处于探索和起步阶段，很多问题有待进一步完善。认为缺乏配套教材和知识体系融合度不够是器官系统教学模式中现存的最主要的问题。
2.1配套教材亟待编写 目前国内还缺乏权威的“器官系统为中心”的系统教材，这是目前“以器官系统为中心”教学中存在的最重要的问题。在免疫系统结构功能与疾病课程教学中仍沿用以学科为纲编写的教材，根据五年制临床医学本科和临床执业医师考试大纲编写教学大纲。学生在学习时必须先后看组胚、生理、医学免疫学、内科学、儿科学等多本教材，没有一本完整系统的教材和参考书指导他们复习和临床实践。随着改革的推进，对配套教材的需求已迫在眉睫。
在教材的编写上，要打破学科界限，突出为临床服务，内容少而精，坚持循序渐进，注意知识的系统性，体现知识新、内容精、学科广。在基础部分编写免疫系统器官组织学、免疫系统功能、免疫调节等，临床部分主要编写常见的自身免疫性疾病与免疫缺陷病等，对内科、儿科、影像学诊断、体格检查、诊断与鉴别诊断、治疗等内容按照增新删旧的原则进行教材重组，比如类风湿关节炎增加2009年ACR分类诊断标准。
2.2教学内容有待进一步融合 由于教研室原因，《医学免疫学》安排在第三学期，本课程整合时，仅将免疫组织学、自身免疫性疾病、儿科学免疫系统疾病和免疫缺陷病等内容融合在一起，安排在第五学期上课，故在免疫系统器官功能与疾病的整体性有所欠缺。由于目前处于教改的初级阶段，在缺乏配套教材的情况下整合内容时难免会出现只是形式上把基础和临床学科的内容“拼合”在一起，缺少基础与临床的内在关联而达到内容上的相互渗透与有机融合，容易导致教学内容上的分散或脱节。因此建议在学校统一组织协调下，本课程最好能将医学免疫学和免疫组织学和免疫系统疾病有机融合。
“器官系统为中心”教改中从管理层到教师都高度重视，在课程整合和教学实践中力争做到内容上的“融合”。在管理上采用了教改课题立项和课程负责人的形式。每个系统遴选一位临床教师作为课程总负责人，每个学科选一位教师作为该学科负责人组成课程组，参与教学的教师都是具有"整合"理念、知识渊博、综合能力强、教学经验丰富的教师。免疫系统课程组在教改课题立项后立即召集基础部、临床学院和儿童学院三个院系课程组教师反复讨论、商榷教学大纲、确定教学内容。在课程开始前、课程中、课程结束考试前进行集体备课，并与学生进行沟通，共同讨论不断发现教学中的问题并及时改进教学内容。
2.3加强师资是关键 传统的教学理念是“三段式”教学，大多教师的思维方式是以学科独立的授课方法和手段来实施教学活动，临床疾病严格按照概念一病因一病理一临床表现一实验室检查和其他检查一诊断和鉴别诊断一并发症一治疗一预后一预防的思路实施授课，方法过于死板，没有系统性、边缘性和交叉性。以“器官系统为中心”的教学模式需要知识渊博、经验丰富、综合能力强和具有先进的教学理念的教师，采用启发式、讨论式等灵活的教学方法，多媒体、道具等丰富的教学手段，坚持求实创新、与时俱进的原则，及时与多个教研室教师沟通，有效实施教学内容的重组，解决学科之间的脱节和重复现象，以培养符合新世纪需求的德才兼备的学生，充分发挥教师教书育人的天职。
【摘要】
目的: 构建人源抗肝癌噬菌体单链抗体库， 从中筛选抗肝癌单链抗体（scFv）， 并对其特异性进行鉴定。方法: 采用体外致敏法和EBV转化技术联合噬菌体展示技术构建噬菌体抗体库。对初级抗体库进行亲和富集及ELISA筛选， 获得的阳性克隆进行免疫组化鉴定并测序。结果: scFv基因与载体连接后得到库容量为1.0×108的初级噬菌体抗体库。对抗体库进行3轮正负淘选和富集后， 随机挑取2798个克隆进行ELISA， 发现3个克隆对HepG2呈强阳性反应， 而与QSG7701等人正常细胞系呈弱阳性或不反应。对克隆SA3进行免疫细胞化学鉴定， 结果与ELISA一致。免疫组织化学鉴定表明SA3与肝癌组织和肝组织阳性率的差别有统计学意义。结论: 构建了库容量达1×108的全人源抗肝癌噬菌体抗体库。通过淘选富集、 ELISA和免疫组织化学鉴定获得特异性较强的噬菌体克隆， 为肝癌的临床诊断及导向治疗奠定了基础。
【关键词】 EB病毒转化 噬菌体抗体库 肝肿瘤 单链抗体
[Abstract] AIM: To construct a fully human antihepatoma singlechain phage antibody library， select the antihepatoma scFv from it and identify its characteristics. METHODS: A fully human scFvdisplaying phage library was constructed by using phage antibody library technique in combination with in vitro immunization and EBV transformation. The library was subjected to three rounds of positive and negative cell panning and enrichment and then it was selected by ELISA. The binding specificity of phage antibodies with hepatoma carcinoma cells was confirmed by immunohistochemistry. RESULTS: After scFv genes being cloned into vector Fuse5 and transformed into E.coli MC1061 via electroporation， a phage antibody library containing 1.0×108 TU (transduced unit) was obtained through tetracyclineresistant screening. After panning， enrichment and testing by ELISA， 3 phage antibody clones reacting more strongly to HepG2 than QSG7701 were picked out of 2798 clones. One clone， SA3， was further analysed after DNA sequencing. The results of immunohistochemistry with cultured cells were similar to those of ELISA. SA3 reacted specifically to hepatoma cells in most human hepatoma tissue sections but in few human normal liver tissue sections. The distinction of positive rates is of a great statistical significance. CONCLUSION: A fully human antihepatoma scFv fusion phage library has been constructed. ELISA and immunohistochemistry results conform SA3 specifically bind with hepatoma carcinoma cells. The scFv fragment against hepatoma may be further developed and applied in clinical diagnosis and therapy of liver cancer.
[Keywords]EBV immortalization; phage antibody library; hepatoma; scFv
肝癌是一种恶性程度极高的肿瘤， 是我国和亚洲地区的常见病和多发病， 病死率居恶性肿瘤的第3位[1]。肝癌90%以上为原发性， 发病隐匿， 发现时多数已处于中晚期， 丧失了手术时机。目前的化疗药物由于缺乏肝癌细胞特异性而具有明显的副作用。单克隆抗体（mAb）以其特异靶向性在放射免疫诊断和导向治疗方面有较大的应用价值， 但其作为鼠源蛋白容易引起机体排斥反应，限制了它的临床应用。噬菌体抗体库技术的出现并发展成熟使获得人源小分子抗体成为可能[2]， 它克服了mAb制备时效率低、 杂交瘤体外培养不稳定等缺点， 便于筛选针对多种抗原的抗体， 而且可以直接获得抗体的基因序列， 可以方便的通过基因工程手段进行改造并大量生产。为提高筛选到特异性抗体的几率， 我们实验室创立了体外致敏和EBV (EpsteinBarr virus， EBV)转化技术联合噬菌体展示技术构建全人源噬菌体抗体库的技术[3， 4]， 并筛选到了特异性抗体。本研究我们即从利用此方法构建的抗肝癌人源单链抗体库中筛选出抗肝癌细胞单链抗体(scFv)， 为肝癌的诊断和治疗奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 丝状噬菌体Fuse5， 大肠杆菌菌株K91Kan， 肝癌细胞系HepG2， 肝细胞系QSG7701， 脐静脉内皮细胞系HUVEC均由本室保存。小牛血清(NBS)为杭州四季青公司产品。高糖DMEM、 琼脂糖和细菌培养基购自Gibco/BRL公司。cDNA合成试剂盒， Sfi I限制性内切酶， Pfu DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自Fermentas公司。质粒小量抽提试剂盒购自安比奥生物技术公司。HRP标记的鼠抗M13 mAb（HRP/antiM13 Monoclonal Conjugate， HRP/antiM13）购自Pharmacia Biotech公司。20份肝癌患者（病理检查确诊）外周血标本采自湖南省肿瘤医院和湘雅二医院， 术前1 d采血。43例肝癌组织石蜡切片由中南大学湘雅医院、 湘雅二医院病理科提供， 12例肝组织（非肿瘤组织）石蜡切片由湖南省人民医院病理科提供。
1.2 方法
1.2.1 细胞常规培养 各种细胞系均用含100 mL/L NBS的高糖DMEM培养基在37℃ 50 mL/L CO2培养箱中培养。
1.2.2 噬菌体单链抗体库的构建 从肝癌患者外周血分离单个核细胞(PBMC)后用肝癌细胞HepG2抗原进行体外致敏和EBV转化。抽提转化后B细胞总RNA并逆转录合成cDNA第1链， 以此为模板扩增抗体可变区基因并连接成scFv， 继而克隆入载体Fuse5构建噬菌体单链抗体库。具体实验操作参考文献[3， 4]进行。
1.2.3 噬菌体抗体库的富集淘选 取抗体库1 mL(含1011 TU(转化单位))用10 g/L BSA（牛血清白蛋白）溶液稀释至2 mL， 在37℃依次与2瓶QSG7701细胞各孵育1 h， 得到递减的噬菌体上清; 将递减上清与肝癌细胞HepG2在37℃孵育1 h; 弃上清，
用含0.5 mL/L Tween20的PBS(磷酸盐缓冲液)（PBST）冲洗细胞10次后加入2 mL Ebuffer（BSA 1 g/L， 甘氨酸6.2 g/L， pH2.2）， 室温下作用10 min洗脱噬菌体， 之后用0.375 mL Nbuffer（1 mol/L TrisHCL pH9.1）中和; 洗脱的噬菌体抗体感染大肠杆菌K91Kan并铺到含四环素(40 mg/L)的LB琼脂糖平板上， 37℃培养16 h以扩增噬菌体; 扩增的噬菌体用200 g/L PEG8000/NaCl沉淀后溶于0.02 mol/L PBS即为经第1轮淘选富集后的抗体库， 并测滴度。如此进行3轮淘选富集， 从第3轮淘选后涂布的LB平板上随机挑取单克隆至含四环素的LB培养基中， 37℃ 220 r/min振摇培养过夜， 菌液离心后收集上清用于下一步实验。
1.2.4 ELISA鉴定 将培养的细胞接种于96孔培养板， 以此为抗原板， 克隆上清为一抗， HRP/antiM13为二抗， 进行间接法ELISA， 用ABTS显色后测定A405。实验以空白载体Fuse5为阴性对照， 阳性阈值为阴性对照A405的均值（x）与其3倍标准差（s）之和[3]。选择与肝癌细胞反应强而与正常细胞弱反应或不反应的克隆进行进一步鉴定。
1.2.5 硫氰酸铵（NH4SCN）洗脱法阳性克隆相对亲和力测定 按文献[5]报道的方法测定阳性噬菌体克隆的相对亲和力。经NH4SCN洗脱后A405值下降至原来的50%时NH4SCN的浓度即为该抗体的相对亲和力指数， 以mol/L表示， 通过比较相对亲和力指数来衡量亲和力的高低。
1.2.6 免疫细胞化学鉴定 培养细胞接种于无菌载玻片， 待贴壁后冷丙酮固定15 min。用SA3噬菌体浓缩上清为一抗， HRP/antiM13为二抗进行免疫细胞化学反应。最后用新鲜配置的二氨基联苯胺(DAB)显色5～10 min， 显微镜下控制染色程度; 苏木素复染， 10 mL/L盐酸乙醇分色， 饱和碳酸锂返蓝后玻片经梯度乙醇逐级脱水， 二甲苯透明， 封片， 镜检。
1.2.7 免疫组织化学鉴定 石蜡切片脱蜡下行至水后进入pH6.0的柠檬酸盐抗原修复缓冲液中进行微波抗原修复; 30 mL/L H2O2甲醇室温孵育30 min以封闭内源性过氧化物酶; 其余步骤同免疫细胞化学。
1.2.8 DNA序列测定 用质粒小抽提试剂盒抽提噬菌体克隆SA3的DNA进行测序。
2 结果
2.1 噬菌体单链抗体库的构建 抗体可变区基因连接成scFv后长度为800 bp左右（图1）， scFv克隆入Fuse5后计算所构建噬菌体抗体库的库容量为1.0×108。scFv基因插入率为80%。
图1 VH和VL基因连接组装的ScFv基因（略）
Fig 1 scFv genes combined with VH and VL genes
M: DNA marker; 1-6: scFv genes.
2.2 抗体库的淘选和富集 对初级抗体库进行了3轮正负淘选， 洗脱的噬菌体滴度测定显示第2轮和第3轮的回收率逐级增加（表1）， 说明经过淘选后阳性克隆已得到富集。
表1 各轮淘选过程中噬菌体的回收率（略）
Tab 1 The recall rate of phage in every round of biopanning
Recall rate=Eluted phage titer/Input phage titer.
2.3 ELISA筛选 从第3轮淘选后的LB平板上随机挑取2798个单克隆培养， 菌液离心后收集上清进行间接法ELISA检测， HepG2阳性率为35%。但这些阳性克隆大部分与QSG7701也有不同程度的阳性反应，
与HepG2反应强而与QSG7701反应弱且差别较大的克隆有3个， 分别命名为SA1、 SA3和SA10（表2）。
表2 HepG2阳性克隆的ELISA结果（略）
Tab 2 ELISA results of selected antihepatoma scFv fusion phage clones
2.4 NH4SCN洗脱法相对亲和力测定 用NH4SCN洗脱法测定了三个阳性克隆的相对亲和力（图2）。SA1、 SA3和SA10的相对亲和力指数分别为2.3、 2.7和2.4 mol/L。
图2 三个阳性克隆的相对亲和力（略）
Fig 2 Relative affinities of 3 phage antibodies
2.5 免疫化学鉴定 根据亲和力指数决定首先对克隆SA3进行鉴定。免疫细胞化学中细胞经DAB显色后镜检可见克隆SA3与肝癌细胞系HepG2呈较强阳性反应， 细胞质和细胞膜被染成较深的棕黄色， 而其他细胞DAB染色不明显（图3A～D）， 与ELISA结果相一致。免疫组织化学鉴定以切片在显微镜下观察时所见的阳性细胞数的多少判断阳性或阴性， 具体标准如下: 无阳性细胞着色或阳性细胞数50%为强阳性（++）。统计发现克隆SA3与大多数肝癌组织呈阳性反应， 而仅与极少数肝组织呈阳性反应， 阳性率差别有统计学意义（表3）， 阳性部位主要见于细胞膜（图3E～H）。
表3 克隆SA3免疫组织化学阳性率比较（略）
Tab 3 Comparision of phage clone SA3’s positive rates in different tissues
bP
2.6 DNA序列测定和分析 噬菌体克隆SA3 DNA测序结果经Immunoglobin BLAST分析: SA3全长744 bp， 含linker序列42 bp; 重链可变区（VH）处于linker上游， 轻链可变区（VL）处于linker下游; VH基因与人胚系基因IgVH323有93.1%的同源性， VL基因与人胚系基因IgVL545有94.5%的同源性。
图3 克隆SA3免疫细胞化学与免疫组织化学染色（略）
Fig 3 Immunohistochemical staining of cells and tissues with SA3
A: HepG2(×100). Cell membrane and plasmic staining is predominant; B: HUVEC(×100). Negative reaction; C: QSG7701(×100). Negative reaction; D: Negative control(×100); E: Liver cancer tissue (×100). Tissue are stained prominently; F: Liver cancer tissue (×300). Cells are stained prominently; G: Normal liver tissue (×100). Tissue are stained weakly; H: Negative control tissue(×100).
3 讨论
噬菌体抗体库筛选方法有多种， 目前文献报道的特异性噬菌体抗体多数是由已知的纯化抗原筛选得到的。但在有些情况下抗原纯化是非常困难的（如细胞膜蛋白）， 在这种情况下筛选抗体的难度非常大， 而肿瘤抗原绝大多数都是如此， 所以在很长的一段时间里噬菌体抗体库技术没有用来筛选肿瘤特异性抗体。但近几年， 已经有用完整的细胞当作抗原成功筛选到针对肿瘤抗原的抗体的报道[6]， 如黑素瘤特异性抗体[7]。为了提高从文库中筛选出特异性抗肝癌细胞的scFv的效率， 我们使用了细胞正负淘选法[8]， 即在用肝癌细胞孵育之前， 首先用正常肝细胞对文库进行吸附， 以除去抗体库中与肝细胞表面抗原有交叉反应的抗体。此方法已有不少成功的前例， 如Hemminki等[9]利用这种方法筛选到了特异性抗体。但在本研究中结果并不理想， 原因可能是我们所用的抗原是完整的细胞， 而细胞膜的成分极其复杂， 膜抗原的有效浓度可能很低， 因此噬菌体抗体的非特异性结合很多， 加大了筛选的难度。
在实验中我们所用的抗原为完整的细胞， 因此所筛选抗体针对的抗原到底为何尚不确定， 这就使得测定抗体亲和力常数非常困难， 所以本实验只测定了3个阳性克隆的相对亲和力大小， 而其绝对的亲和力指数尚无法检测。而我们筛选的抗体所针对的抗原到底是何种分子也成为了进一步鉴定工作的重要内容， 否则可能直接影响其实际应用。
SA3的ELISA、 免疫细胞化学结果显示克隆SA3与肝癌细胞系HepG2呈强阳性反应， 与其他细胞反应不明显。石蜡切片免疫组化结果显示与人肝癌组织和肝组织的阳性率差别有统计学意义。据此可初步判断SA3克隆对肝癌具有良好的特异性， 但其是否能用于肝癌的诊治还需要后续实验进一步的验证。
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各位老师、各位领导：
大家下午好！
我叫荣俊，是生命科学学院的一名普通教师。今天有机会站在这里，主要是与大家进行交流，分享一下从事科研工作的体会。
今年1月10日，我在北京参加了2013年度国家科学技术奖励大会，我参与的一个项目获得了国家技术发明二等奖。
这个项目名称叫《传染性法氏囊病的防控新技术构建及其应用》，是由浙江大学、长江大学、北京市农林科学院、青岛易邦生物工程有限公司共同完成的。长江大学是第二完成单位。作为主要完成人，我排名第三，动物科学学院的程太平副教授排名第六。
算起来，进行这个项目的研究，前前后后已有20多年。项目组在“863”“科技支撑”“973” 等计划项目的持续资助下，构建了传染性法氏囊病病毒（IBDV）反向遗传学技术平台，揭示了传染性法氏囊病病毒的基因重配和复制的机制，发展了具有国际领先水平的安全的传染性法氏囊病新型疫苗、检测技术体系，尤其是发明的基因工程亚单位疫苗在养鸡生产上的广泛应用，为减少疫病发生、消除传染性法氏囊病病毒变异、净化鸡场的传染性法氏囊病作出了重大贡献。
作为成果第三完成人，我主持了鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的研究，组织实施了传染性法氏囊病毒VP2 基因改造、基因表达、表达产物纯化、油乳剂疫苗生产工艺研究，动物实验研究，获得了国家授权发明专利、农业部签发了国家II类新兽药注册证书和准予生产产品批准文号、获得国家重点新产品证书1 个。
尤其值得欣慰的是，我的发明专利技术在青岛易邦生物工程有限公司得到了具体实施和应用，作为国家重点新产品，该疫苗已连续生产5年并在全国除香港和澳门所有省、市、自治区推广使用，实现销售收入4.776 亿元，新增利税收2.134亿元。目前本成果产品的国内市场份额达到70%以上。
回顾我的科研历程，我觉得，有几点感受较深的体会，在此与大家分享。
第一，科研成果的获得是大量时间和精力投入的结果。
记得党委书记朱业宏来看我时我曾经说过一句话，我绝对不是长江大学做科研中最聪明的和最有水平的，但我肯定是最勤奋的。以这次获奖项目的研究过程为例：传染性法氏囊病基因工程疫苗的研究，1999年立项，2000年经费到账后进行理论研究和前期准备。从2001年到项目通过鉴定这4年时间里，我的工作时间是每年360天。没有节假日和星期天，每年春节后一般都是初二或初三去实验室工作。经常是我到实验室了，管门房的工人还没有起来开门。
第二，不要抱怨自己所在单位的条件不好，充分利用现有试验设备和试验条件你一定会获得成功。将普通设备用好也是一种创新。
我们有很多新教师和老教师习惯报怨单位没有好的研究条件，其实好多人都没有真正了解自己试验室有些什么东西，能做什么。其实这是一种缺乏进取心、自我解压的心理表现。其实在我的研究早期是没有什么试验设备的。当时有不少同事挖苦我要在湖北农学院研究基因工程疫苗，认为这是不可能的事。我们做基因工程疫苗抗原蛋白的表达必须做western blot，而我们实验室没有转膜电泳槽，我就根据在武汉大学用过的仪器构造和原理，拆下报废电泳槽上的铂金丝自己制作了一个转膜电泳槽，用我自制的设备做的实验非常成功。用这个设备做的western blot 照片在2篇SCI论文（3.0以上）中应用。
在青岛易邦公司做工艺时，要增加一步去内毒素的工艺，公司的员工要去买冷冻离心机，每台需大约45万元。我帮他们设计了一个可放置5个5升分液漏斗可移动操作台，可以在冷库和操作间移动。每个台架加分液漏斗可相当两台离心机。而每个台架的造价不到1000元。易邦的老总感叹道，现在年轻的研究人员只知道现代化的设备，对那些管用又便宜的玻璃仪器一无所知。像这样的例子在我的科研实践中还有不少。
第三，国家的需求社会的需求是科研选题的最重要标准。
上世纪末和本世纪初正是我国动物疫苗生产由传统疫苗向现代新型疫苗转型的初期。人类医药中乙型肝炎病毒基因工程亚单位疫苗成功研制和应用，产生了巨大的社会效益和经济效益。在兽医中还没有一个叫得响的产品，与我们前后同时进入新药申报的基因工程疫苗有：复旦大学的猪口蹄疫病毒基因工程亚单位疫苗，西南农大的猪伪狂犬病基因缺失疫苗。这两个疫苗因为免疫效果不佳没有能推广开。其中复旦大学的疫苗转让给内蒙古金宇集团后基本没有生产。从特定疫苗生产的专业角度更是急需的产品。我们的产品是在产业转型的关键时期推出的，是国家和社会急需的东西。2011年春天，我到荆门十里铺去买鸡做实验，我特地问了一下养鸡户，你们免疫传染性法氏囊病用什么疫苗，他们告诉我他们附近的养殖户都用青岛易邦的疫苗，效果非常好，免疫后基本上都可以不患法氏囊病。他们不知道我是该疫苗的发明者。听到这样的评价我真正有了成就感。
第四，千万不要迷信文献资料和专家权威。
从1990年起就有国外的论文报道用原核生物表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白做疫苗是行不通的。我们的研究真真切切的让这种不可能变为了可能。在我们进行新药申报的过程中也曾有国内的顶级专家提出质疑，其理由就是两个：一是国外权威杂志的论文和结论；二是他们自己做过没有成功。所以专家权威不可全信。
华中农大的陈焕春院士知道我们这个产品后，对他们试验室的博士们发出感慨道，荣老师在长江大学做的产品卖到易邦去了（因为易邦公司在国内是排第二的兽药企业）。所以作为长江大学人要有我们的自信。
第五，成功的最关键时刻是咬紧牙再坚持一会。
在该项目的研究中有两次令人崩溃的时候。第一次是获取目的基因，由于病理样本中病毒数太少，加上当时缺乏经验，实验基本上是按书本来做。当时相同的工作反复做了10个月。反转录，PCR，电泳，转化，鉴定。每星期重复2-3次，最后终于取得了正确的基因。第二次是在青岛易邦做工艺时，遇上了副反应的问题。这种问题在试验室比较不明显，在免疫的局部出现核桃大小的结蒂组织增生。那时是三个星期一个轮回，制苗，免疫，剖检。反复改进工艺和疫苗配比，经过11个月完成了工业生产工艺流程。
说完这些科研体会，我还想说一下感恩，做人必须常怀感恩之心。说实话，我真心感谢原农学院和现在的长江大学，为我提供了展示自己的舞台。
感谢原湖北农学院为我提供了当时院内最高的资助，8万元。正是湖北省科技厅的2万元加上湖北农学院的8万元使我能够完成该项目。我现在是不差钱，但在当时这点钱是甘露。
感谢易邦公司的老总，杜元钊总经理，在两次巨额赔款后仍然对该产品充满信心。2次赔了300多万。
感谢生科院给了我相对比较宽松的环境和条件。
感谢动科院在我离开学院后还能为我敞开试验室。
感谢朱业宏书记亲临看望，使我这个一线的科研人员深切地体会到了组织的关怀和温暖。
【摘要】 目的: 构建口蹄疫病毒VP1基因的真核表达载体， 转染并筛选稳定表达VP1的树突状细胞(dendritic cell， DC)。方法: 将pMD18VP1克隆于pcDNA3.1(+)中， 构建重组质粒， 酶切鉴定， DNA测序证实序列正确后， 利用脂质体将重组质粒转染DC， 经含G418培养基筛选获得抗G418细胞克隆， 用Western blot鉴定FMDV VP1基因在DC中的表达。结果: 构建的pcDNA3.1VP1真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及序列分析证实了其序列的正确性， SDSPAGE和Western blot结果显示G418筛选获得DC稳定表达VP1。结论: 成功地构建了重组质粒pcDNA3.1 VP1真核表达载体， 并在DC中得到稳定表达。
【关键词】 口蹄疫病毒; VP1基因; 真核表达; 细胞转染; 树突状细胞
[Abstract] AIM: To construct the eukaryotic expression vectors for the FMDV VP1 gene and transfect dendritic cells(DC) for the expression of VP1. METHODS: The plasmid pMD18VP1 was subcloned into pcDNA3.1(+) to construct recombinant eukaryotic expression plasmids named as pcDNA3.1VP1. The recombinant plasmids were transfected into DC by lipofectamine method and the positive cell clones were screened with G418. The expression of FMDV VP1 gene in DC was determined by Western blot. RESULTS: The correct construction of pcDNA3.1VP1 was identified by means of restriction enzyme analysis and nucleotide sequence determination. It was showed by SDSPAGE and Western blot that transfected cells， DC， expressed FMDV VP1 gene constantly. CONCLUSION: The pcDNA3.1VP1 eukaryotic expression plasmids are successfully constructed and VP1 gene can be sustainly expressed in DC.
[Keywords]footandmouth disease virus; VP1 gene; eukaryotic expression; cell transfection; dendritic cell
口蹄疫病毒(footandmouth disease virus， FMDV)分为O、 A、 C、 Asia I、 SAT1、 SAT2和SAT3等7个血清型。FMDV衣壳由4种结构蛋白VP1、 VP2、 VP3、 VP4各60分子组成， 其中VP1为主要的抗原蛋白， 在已发现的O型5个抗原位点中有3个位于VP1上。在VP1第140～160位氨基酸处有一个长的、 结构稳定的GH环， 环上的氨基酸构成能刺激免疫应答的T、 B细胞抗原表位， 是病毒表面的主要抗原位点， 在其顶部形成一个高度保守的ArgGlyAsp(RGD)序列， 是FMDV与宿主细胞受体相结合的位点[1， 2]。VP1是口蹄疫病毒中惟一能够产生中和抗体的最重要的结构蛋白， 它以突起的形式暴露在病毒粒子的表面， 在免疫应答中发挥着主要作用[3]。因此， VP1成为各类新型疫苗研究的主要抗原之一。DC是目前已知的功能最强大的专职性抗原提呈细胞， 并能以交叉途径提呈非复制性抗原， 激活CD8+T细胞， 从而发挥对病原体的杀伤作用[4]。基因转染的DC可以激活CD8+T细胞产生IFNγ[5]， 并诱导CD4+T细胞产生更多的Th1型细胞因子， 因此， 基于DC的基因工程研究已成为抗病毒免疫的一个热点问题[6]。有报道显示， DC在机体抗FMDV感染免疫中发挥重要作用[7]， 但野毒感染可造成DC功能严重损伤。同时， 由于对FMDV的灭活处理可直接改变病毒蛋白的抗原性质， 所以用灭活FMDV作为抗原来源研究DC提呈抗原的机制则不能反映机体的自然过程。因此， 将FMDV的VP1基因转染DC， 使其表达VP1就成为研究DC提呈FMDV抗原机制的理想途径之一。本研究中， 我们构建了口蹄疫病毒VP1基因的真核表达质粒pcDNA3.1VP1， 利用脂质体转染DC， 得到了稳定表达。
1 材料和方法
1.1 材料 O型FMDV的pMD18VP1质粒由军事兽医学研究所金宁一教授惠赠， 大肠杆菌感受态细胞DH5α和普通质粒小提试剂盒购自北京天根公司， 凝胶回收试剂盒、 T4连接酶、 EcoR I、 Hind III、 Sac I限制性内切酶购自大连宝生物公司， D7500和D2000为北京天根公司产品， LipofectamineTM 2000 Reagent为invitrogen公司产品。G418为Solarbio公司产品。仓鼠抗小鼠CD11c购于BioLegend公司， 异硫氰酸荧光素标记(FITC)羊抗仓鼠IgG和FITC标记羊抗小鼠IgG购于eBioscience公司， FITC标记羊抗兔IgG购Santa Cruz公司， 小鼠抗MHC ClassⅡ1Ab购于Chemicon公司， 硝酸纤维膜(NC 0.45 μm)购于Scientific Research Special公司。
1.2 方法
1.2.1 单核细胞源树突状细胞(MoDCs)的制备 无菌条件下， 用摘眼球法进行BALB/c小鼠采血， 放入含肝素钠的离心管中， 摇匀。加入等量的Hank’s液， 混匀。然后轻轻至于淋巴细胞分离液上， 使二者之间有一清晰界面， 室温下， 以2 000 g离心20 min。用滴管吸出中间薄层细胞， 用Hank’s液悬浮细胞， 室温下， 以1 500 g离心10 min， 洗涤2次。弃去上清液， 然后用RPMI 1640完全培养液将细胞悬液加入到培养瓶中， 置37℃、 50 mL/L CO2培养箱中孵育3 h后弃上清液， 用37℃预热RPMI 1640完全培养液轻轻洗涤贴壁细胞2次， 去除非贴壁细胞， 即得贴壁单核细胞。在培养瓶中加入含20 μg/L rmGMCSF和20 μg/L rmIL4的RPMI 1640完全培养液中培养， 每隔两天半量换液1次， 补充新鲜培养液， 连续3次。第7天， 弃去非贴壁细胞， 加入5 mL， 5 mol/L EDTA/PBS于培养皿中， 37℃孵育20 min， 反复用力吹吸培养瓶中的培养基， 使贴壁细胞完全脱落， 室温下1 500 g离心10 min， 吸去上清， 将沉淀重悬在适量的RPMI 1640完全培养液中， 用DMSO配成10%细胞悬液， 冻存于液氮中备用。
1.2.2 MoDCs的鉴定 将MoDCs分别用小鼠抗MHC ClassⅡ1-Ab和仓鼠抗小鼠CD11c以及兔抗牛S100多克隆抗体标记MoDCs， 再依次加入FITC标记羊抗鼠IgG， FITC标记羊抗仓鼠IgG和FITC标记羊抗兔IgG， 进行免疫荧光染色， 用流式细胞仪(FACS 420型)对其进行表型分析鉴定。
1.2.3 pcDNA3.1VP1重组质粒的构建 将pMD18VP1重组质粒和转座载体pcDNA 3.1(+)， 分别用EcoR I及Hind III进行酶切， 37℃ 酶切5 h， 用TaKaRa凝胶纯化回收试剂盒的方法回收VP1基因片段及线性化pcDNA 3.1(+)， 用T4 DNA连接酶16℃连接过夜， 构建重组转座质粒pcDNA3.1VP1， 转化大肠杆菌DH5α， 挑取单菌落， 提取质粒经酶切鉴定， 并进行测序。
1.2.4 G418浓度梯度实验 复苏MoDCs进行计数， 用无血清RPMI 1640培养液调整细胞密度为1×106/L， 接种于24孔培养板中， 每孔加入100 μL的细胞悬液及无双抗的培养基900 μL。每孔中添加G418浓度为0、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900、 1 000、 1 100 mg/L 12个等级， 每3 d换1次液， 培养14 d记录细胞全部死亡的最低浓度。以最低浓度向上增加一个稀释度作为筛选浓度。
1.2.5 质粒的线形化处理 pcDNA3.1VP1用Sac I酶切处理5 h， 在紫外灯下回收目的片段， 称重， 用凝胶回收试剂盒回收， 纯化(线性化的质粒利于细胞的转染)。
1.2.6 转染MoDCs 复苏MoDCs后5 h进行计数， 用无血清培养液调整细胞密度为1.2×109/L， 接种于6孔培养板中， 于37℃、 50 mL/L CO2的饱和度湿度下培养， 待细胞生长至70%～80%覆盖率时进行转染。按照LipofectamineTM2000试剂盒操作说明书进行空质粒pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1VP1的转染MoDCs， 转染后48 h加入G418 (浓度为0.9 μg/L)选择培养基加压筛选14 d后， 筛选得到阳性细胞克隆。扩增培养即为稳定表达口蹄疫VP1基因的MoDCs， 命名为DCVP1细胞。
1.2.7 用重组质粒pcDNA3.1VP1免疫动物制备血清 选用3只健康的成年实验鼠， 第1次用普鲁卡因预处理后， 肌肉注射pcDNA3.1VP1质粒DNA， 每只100 μg， 14 d后进行第2次肌肉注射， 每只注射100 μg， 1月后， 进行第3次肌肉注射， 每只100 μg， 1月后从实验鼠的眼静脉采血， 制备血清。
1.2.8 阳性细胞克隆的Western blot检测 收集转染细胞， 用裂解缓冲液裂解后取20 μg处理后的蛋白样品进行SDS PAGE， 取出凝胶至于硝酸纤维膜(0.45 μm)上， 用BioRad公司的蛋白质转印系统在转移缓冲液中， 电泳转印(20 V， 30 min)， 用50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h(封闭非特异性结合)， 用上述免疫血清作为一抗(1∶50)， 室温2 h， 4℃过夜， 第2天取出NC膜， 室温孵育1 h， 用TBST洗膜3×10 min， 以羊抗小鼠lgGHRP(1∶300)作为二抗室温2 h， TBST洗3×10 min， DAB显色， 观察特异性条带。
2 结果
2.1 小鼠MoDCs的鉴定 从小鼠外周血中分离出的单核细胞在rmGMCSF和rmIL4诱导培养7 d后， 经流式细胞术分析， 99.79%以上的细胞表达MHCII分子， 99.75%以上的细胞表达CD11c， S100的表达率为99.23%， 表明本试验制备成了表型复合度很高的MoDCs(图1)。
2.2 重组质粒pcDNA3.1VP1的构建 将pMD18VP1重组质粒和转座载体pcDNA 3.1(+)， 分别用EcoR I及Hind III进行酶切后， 回收VP1基因片段及线性化pcDNA 3.1(+)， 用T4 DNA连接酶连接， 构建成重组转座质粒pcDNA3.1VP1， 经EcoR I及Hind III酶切鉴定正确， 经琼脂糖电泳后， 在640 bp左右出现特异性条带(图2)， 大小与预期的相符(639 bp)， 测序结果显示VP1基因的读码框正确。
2.3 抗G418细胞克隆的筛选 MoDCs在含有G418(终浓度为800 ng/L)的RPMI 1640培养液中生长10 d后全部死亡， 故900 ng/L的G418应为MoDCs合适的筛选浓度。转染细胞经筛选， 14 d后得到抗G418的阳性细胞克隆， 未转染的细胞则在G418培养液中逐渐死亡， 初步表明VP1基因转染MoDCs成功。
2.4 Western blot检测FMDVVP1在MoDCs的表达 转染pcDNA3.1VP1重组质粒的MoDCs可检测出FMDVVP1的表达(图3)， 而转染空载体pcDNA3.1和空白对照的MoDCs未检测到VP1的表达， 表明转染pcDNA3.1VP1成功。
3 讨论
口蹄疫是偶蹄动物的一种急性传染病， 自1879年Loeffer发现该病以来， 人们为控制该病做了不懈努力。FMDV结构蛋白VP1包含FMDV的主要抗原位点， VP1的141～160及200～213位氨基酸残基均是FMDV的抗原表位， 可刺激机体产生免疫应答[8]。因此， VP1基因在原核细胞或真核细胞中的表达一直是口蹄疫疫苗研究的热点。 本实验中， 我们将目的基因亚克隆到pcDNA3.1(+)表达载体， 对重组质粒进行双酶切电泳鉴定， 结果显示口蹄疫病毒VP1重组载体在640 bp和5 400 bp左右处均出现相应的目的条带， 表明目的基因已成功导入pcDNA3.1(+)表达载体。进一步测序证实， 本实验中口蹄疫病毒VP1基因的序列(639 bp)是完全正确的， 证明本研究已正确构建了pcDNA3.1VP1真核表达载体。通过Western blot鉴定外源性VP1基因在转基因MoDCs中的表达发现， 具有G418抗性的转染重组质粒pcDNA3.1VP1的MoDCs有目的蛋白VP1的表达， 说明DC能表达FMDV的VP1蛋白。总之， 本实验成功构建了口蹄疫病毒VP1基因的真核表达系统， 并在小鼠MoDCs中得到了高丰度表达， 为进一步研究FMDV的抗原提呈和新型疫苗研制奠定了良好的基础。
参考文献
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[3] Logan D， AbuGhazaleh R， Blakemore W， et al. Structure of a major immunogenic site on footandmouth disease virus[J]. Nature， 1993， 362(6420): 566-568.
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[5] Klostermann B， Bellinghausen I， Bottcher I， et al. Modification of the human allergic immune response by allergen DNAtransfected dendritic cells in vitro[J]. J Allergy Clin Immunol， 2004， 113(2): 327-333.
[6] Knig B， Petersen A， Bellinghausen I， Human dendritic cells transfected with allergenDNA stimulate specific immunoglobulin G4 but not specific immunoglobulin E production of autologous B cells from atopic inpiduals in vitro[J]. Immunology， 2007， 122(2): 239-246.
本文作者从实际工作出发，对以下几种食品微生物的快速检测技术进行了全面阐述。
关键词：食品微生物检测快速检测技术
一、主要食品微生物快速检测技术
1 分子生物学技术
（1）PCR技术
通过大量复制目的菌的高度保守的一段或几段特异性DNA并确认这些DN段的大小来完成检测，如果样品中存在目的菌，就能复制出有关特异性DN段，而复制特异性DN段靠聚合酶链反应―PCR技术。
该技术已大量运用到食品微生物检测领域，并形成标准化，如SN/T 1632.2-2005《奶粉中阪崎肠杆菌检验方法 第3部分:荧光PCR方法》、DIN 10135:1999《沙门氏菌聚合酶连锁反应（PCR）检验方法、ISO 20837:2006《食品和动物饲料微生物学―聚合酶链反应（PCR）检测食源病原体―定性检测用样品的制备》
目前利用PCR技术检测病原菌的商品化仪器有被AOAC、USDA-FSIS、Health Canada、AFNOR等权威机构认可的BAX@全自动病原菌检测系统，可检测沙门氏菌、大肠杆菌O157、单增李斯特菌等致病菌，此外还有RiboPrinter@微生物鉴定系统，可鉴定沙门氏菌、大肠杆菌O157、单增李斯特菌和阪崎肠杆菌等致病菌在内的1400多种细菌。
在1996年由美国AB公司推出的实时荧光定量PCR仪，与常规PCR仪相比，它具有特异性更强、有效解决PCR产物污染、自动化程度高，同时能对起始模板进行准确定量等特点。
（2）核酸探针技术
核酸探针是指带有标记的特异DN段。根据碱基互补原则，核酸探针能特异性地与目的DNA杂交，最后用特定的方法测定标记物。探针标记方式为放射性标记、非放射性标记，具有直观、准确等特点，基于核酸探针杂交的基因芯片技术，虽然其灵敏度与PCR技术相当，但其具有高通量、多参数、高精确度和快速分析等特征，所以备受青睐。我国已将此技术引入到行业标准中来，如SN/T 1543-2005《食源性致病菌基因芯片鉴定方法》。
2 免疫学技术
（1）荧光抗体法
用荧光物质标记抗血清的抗体，即抗抗体。使用荧光显微镜观察样品中的目的菌-荧光标记抗体结合物或目的菌-抗体-荧光标记抗抗体结合物来判断结果。在食品微生物检测领域内，国内使用的较多是mini-VIDAS全自动荧光酶标免疫测试系统，该系统已被AOAC、AFNOR等权威机构认可，可检验沙门氏菌、单增李斯特氏菌、大肠杆菌O157、葡萄球菌肠毒素等。
（2）免疫酶技术
以酶标记抗体或抗抗体，抗原与酶标记抗体，或抗原-抗抗结合物与酶标记抗抗体特异性结合。根据酶反应有色反应的有无及其浓度，即可间接推测被检抗原或抗体是否存在及其数量。常用酶技术分为固相免疫酶测定技术、免疫酶定位技术和免疫酶沉淀技术。在食品微生物检验领域内，国内使用比较多的有Reveal@大肠杆菌O157：H7检测系统、Reveal@沙门氏菌检测系统及GeneQuence@李斯特氏菌检测试剂盒、金黄色葡萄球菌乳胶凝集试剂盒等。
（3）免疫磁珠技术
用连接抗体的磁珠捕捉增菌液中的目的菌，然后将捕捉到的抗原即目的菌划线于选择性平板，观察菌落。或用荧光或酶标记的抗抗体进行检测。或用聚合酶链式反应技术进行进一步检测。此技术在ISO 166654:2001《食品和动物饲料微生物学―大肠杆菌O157基准检验方法》上得到了应用。目前可利用该技术对沙门氏菌、大肠杆菌0157、大肠杆菌0145、大肠杆菌O111等进行测试。
（4）免疫层析技术
该技术是一种膜固相免疫测定技术。滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般。移动过程中被分析物与固定于膜上某一区域的抗原或抗体结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后通过标记物的显色来判定实验结果。以胶体金为标记物的实验称为胶体金免疫层析技术，该技术具有简单、快速、准确和无污染等优点，可对食品中大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、布氏杆菌、霍乱弧菌等进行检测。
（5）其它免疫技术
细菌直接计数法主要包括流式细胞仪(flow cytometry，FCM)和固相细胞计数(solid phasecytometry，SPC)法。FCM通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。光散射信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的强度则代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，由此可通过仪器检测散射光信号和荧光信号来估计微生物的大小、形状和数量。流式细胞计数具有高度的敏感性，可同时对目的菌进行定性和定量鉴定。目前已经建立了细菌总数、致病性沙门氏菌、大肠埃希氏菌等的FCM检验方法。
3.其它技术
即用型纸片法
3M公司的perrifilmTMPlate@系列微生物测试片，可分别检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数。由RCP Scientific Inc公司开发上市的Regdigel@系列，除上述项目外还有检测乳杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的产品。3M公司生产的PF(Petrifilm)试纸还加入了染色剂、显色剂，增强了菌落的目视效果，而且避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷。霉菌快速检验纸片，应用于食品检验中的霉菌具有操作简便，仅需36℃培养，不需要低温设备；快速，仅需2d就可观察结果，比现在的国家标准检验方法缩短3～5d，大大提高了工作效率。纸片法与国标法在霉菌检出率上差异无统计学意义，且菌落典型，易判定。
二、食品微生物快速检测技术的局限性
快速检测技术的评估结果表明，其对于某类食品的性能优于其他食品，很大程度上是由于食品成分干扰所致，有些食品成分对于快速检测方法中所应用的技术是比较麻烦的。例如在采用PCR技术时，食物中的高蛋白、高脂肪对Taq酶具有抑制作用，可能导致检测结果假阴性。同时PCR操作过程要求严格，微量的外源性DNA进入PCR后可以引起无限放大产生假阳性结果。
三、结束语
食品病原微生物检测是保障食品安全的重要组成部分，依靠采用培养基增菌培养、分离、生化鉴定及革兰染色镜检等传统检测方法，对实验室技术人员的专业技术、操作技能以及工作经验要求极高，操作步骤复杂繁琐，检测周期长，灵敏度低，准确性差，容易出现假阴性或假阳性结果。近年来，微生物快速检测技术发展迅速，运用分子生物学、电子技术、生物化学、免疫学等技术对微生物进行分离、鉴定和计数，与传统检测方法相比，更快、更方便、更灵敏、更准确。
随着某一快速检测技术更加频繁的使用，其好处与局限性同时变得更加明显，使用者在选择这些快速检测技术时，应考虑此技术的准确性、特异性、实用性、稳定性、灵敏度以及采用此技术的供应价格、认可程度和售后服务等因素，综合判别后进行选择。
参考文献：
［1］雷质文，等.食品微生物实验室质量管理手册[M].北京:中国标准出版社,2006.
［2］李志明，等.食品卫生微生物检验学[M].北京:化学工业出版社,2008.
目的: 构建人β防御素4（human β defensin 4, hbd4）基因的原核融合表达载体pgex4t2/mhbd4, 诱导gsthbd4融合蛋白在大肠杆菌中表达, 并制备其多克隆抗体。方法: 从重组克隆载体pmd18t/hbd4中扩增hbd4成熟肽编码基因, 并克隆入pgex4t2中, 在iptg诱导下, 表达gsthbd4融合蛋白。以表达的融合蛋白gsthbd4作为免疫原免疫家兔制备抗gsthbd4的抗血清, 抗体效价及特异性分别用elisa和western blot法鉴定。结果: 在大肠杆菌中成功表达mr约为32000的融合蛋白gsthbd4。elisa法检测抗血清的效价可达到1∶128000, western blot分析抗血清可与原核表达的融合蛋白gsthbd4特异结合。结论: 在大肠杆菌中成功表达了gsthbd4融合蛋白, 并制备了gsthbd4的抗血清, 为进一步研究hbd4蛋白的结构和功能奠定了基础。
【关键词】 人β防御素4 基因克隆 融合表达
[abstract] aim: to construct the prokaryotic fusion expression vector of human β defensin 4 （hbd4）, and to express gsthbd4 fusion protein in escherichia coli （e.coli ）and prepare polyclonal antibody of gsthbd4. methods: the gene encoding mature peptide of hbd4 （mhbd4）was amplified by pcr from cloning vector pmd18t/hbd4 which contained the fulllength hbd4 cdna and then cloned into prokaryotic expression vector pgex4t2 to construct pgex4t2/mhbd4. gsthbd4 expression was induced by iptg. the antiserum was prepared by immunizing rabbit with gsthbd4.the titer and specificity of the antibody were detected by elisa and western blot, respectively. results: the recombinant expression vector pgex4t2/mhbd4 was successfully constructed. after being induced by iptg, the fusion protein with relative molecular mass of 32 000 was successfully expressed in e.coli and partly expressed in the soluble form in supernatant. the rabbit antibody against gsthbd4 was obtained. the elisa titer of antiserum against gsthbd4 was about 1∶128 000. western blot analysis showed that the antiserum could bind to the expressed gsthbd4 specifically. conclusion: the rabbit antibody against gsthbd4 has been successfully prepared, which lays the foundation for further studying the structure and function of hbd4.
[keywords]human β defensin 4; gene cloning; fusion expression
防御素是最近在动植物体内发现的一类阳离子抗菌肽。哺乳动物防御素可分为α、 β两类。α防御素主要由中性粒细胞和小肠潘氏细胞产生, 而β防御素广泛表达于多种器官的上皮和黏膜细胞, 在使机体免受外界微生物侵袭中有着重要的作用。人类β防御素（humanβdefensin, hbd）有4种亚型(hbd 1～4), 具有杀伤细菌、 真菌、 病毒、 原虫及肿瘤以及免疫调节等多重活性, 而且不产生细菌耐药性, 因此成为国内外众多学者研究的热点[1-3]。国外研究表明, hbd4对多种病原菌有杀灭作用[4]。然而生物体内天然的hbd4含量很低, 分离纯化难度大, 化学合成成本高。因此利用基因工程技术获得大量hbd4成为必然。目前关于hbd4的体外表达及抗体制备等的相关研究, 国内尚未见报道, 国外研究亦非常少。我们在已获得编码此蛋白的全长216 bp的基因序列并构建了克隆载体pmd18t/hbd4的基础上, 旨在构建hbd4原核表达载体, 在大肠杆菌中大量表达hbd4融合蛋白, 并制备其多克隆抗体, 为进一步研究此蛋白的结构和功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1材料 rtaq酶、 4×dntp、 限制性内切酶bamhi、 ecori、 t4 dna连接酶均购自大连宝生物工程有限公司; 含全长hbd4 cdna的重组克隆载体pmd18t/hbd4由第四军医大学西京医院儿科实验室构建。质粒pgex4t2、 大肠杆菌dh5α由第四军医大学生物化学与分子生物学实验室惠赠, 琼脂糖凝胶dna回收试剂盒、 质粒提取试剂盒、 dab显色试剂盒购自天为时代公司。基因测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成, 并经page纯化。hrp标记的羊抗兔igg购自华美公司。家兔由本校实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 hbd4成熟肽编码基因(mhbd4 cdna)的获得 根据genbank报道的hbd4成熟肽编码基因序列, 设计2条引物, 以重组克隆载体pmd18t/hbd4为模板, 进行pcr反应。设计上游引物d1: 5′cgggatccgaatttgaattggacagaatatgtgg3′及下游引物d2: 5′cggaattctcagggttttgtacgattcagtaa3′, 其两端分别设计有ecor i和bamh i酶切位点并引入2个保护碱基, 依次加入载体pmd18t/hbd41 μl作为模板, 上下游引物各1 μl, 10×pcr缓冲液5 μl, 4×dntps 4 μl, rtaq dna聚合酶0.2 μl, 去离子水补充反应体积至50 μl, 进行pcr反应: 94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35循环; 72℃ 5 min, 产物在20 g/l琼脂糖凝胶上电泳。
1.2.2 原核表达载体pgex4t2/mhbd4的构建及鉴定 pcr产物于20 g/l琼脂糖凝胶上电泳, 切下目的条带, 用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收目的mhbd4 cdna, 凝胶回收产物用bamh i和ecor i酶切后克隆入后接表达载体pgex4t2中, 转化感受态大肠杆菌dh5α, 将转化菌接种含100 mg/l氨苄青霉素的lb平板上37℃孵育过夜, 挑选多个单菌落接种于含氨苄青霉素的lb培养基中, 37℃振荡过夜,采用质粒提取试剂盒提取质粒, 经bamh i和ecor i双酶切, 10 g/l琼脂糖凝胶电泳, 鉴定与预期结果相似。将鉴定正确的含目的片段的质粒送交上海生工公司测序。
1.2.3 hbd4蛋白的诱导表达 测序正确的阳性克隆菌于含氨苄青霉素100 mg/l的lb培养基中, 摇床培养过夜, 次晨将10 ml的菌液加入1000 ml的lb培养基中, 37℃培养至对数生长期(a600=0.4～0.6)。然后加入iptg诱导融合蛋白表达(iptg的终浓度为0.1 mmol/l), 诱导8 h后, 以10000 r/min离心5 min收菌, 置-70℃冻存。在冰浴中解冻部分冻存的菌体, 重悬于2 ml冰预冷的裂解缓冲液(50 mmol/l nah2po4、 300 mmol/l nacl、 0.1 g/l溶菌酶及1 mmol/l pmsf, ph8.0)中, 置冰浴中15 min, 用超声破碎裂解细胞, 12000 r/min离心20 min, 分别取适量诱导后的全菌及裂解后的上清与沉淀进行sdspage电泳。
1.2.4 兔抗gsthbd4融合蛋白抗体的制备 以上述方法在1000 ml培养液中大量诱导gsthbd4融合蛋白的表达, 离心收菌, 加入20 ml去离子水和等体积的2×上样缓冲液, 煮沸10 min, 离心后取上清进行sdspage, 凝胶经考马司亮蓝染色, 充分脱色后, 切下目的蛋白条带, 研碎溶于少量生理盐水中[5]。取成年家兔2只, 选腹股沟和脊柱两侧为注射点, 多点注射凝胶悬液进行免疫。首次剂量约为500 μg, 其后加强免疫的剂量减半。于初次免疫后4周, 加强免疫1次, 此后每隔2周加强免疫1次, 共3次。末次加强免疫后的第10天, 抽血, 分离血清。
1.2.5 兔抗gsthbd4抗体效价的测定 采用间接elisa法检测抗体效价。用裂解上清(含可溶性gsthbd4融合蛋白, 浓度约为1.0 mg/l), 包被elisa板, 4℃过夜。弃去孔内液体, 用洗涤液(1×pbs, 含0.5ml/l tween20)洗涤3次, 每次3 min。留取1孔加入100 μl稀释液作空白对照外, 其余各孔加入100 μl稀释的待测抗体或未免疫兔的血清, 37℃温育1 h(稀释液为1×pbs, 含0.5 ml/l tween20, 1 ml/l bsa)。洗涤后每孔加稀释的hrp羊抗兔igg 100μl(1∶1000稀释)作为二抗, 37℃温育1 h, 洗涤后每孔加100 μl新配制的dab显色液, 37℃温育20 min。每孔加50 μl2 mol/l h2so4终止反应后, 读取a490值。
1.2.6 兔抗gsthbd4融合蛋白抗体特异性的western blot分析 将含有表达质粒pgex4t2/mhbd4的大肠杆菌dh5α的全菌蛋白, 经sdspage分离, 并转移至硝酸纤维素膜上, 以50 g/l脱脂奶粉于室温封闭1 h后, 加入1∶1000稀释的兔抗gsthbd4融合蛋白抗血清37℃温育1 h, 以tbst室温洗膜3次后, 加入1∶1000稀释的hrp标记的羊抗兔igg作为二抗同上温育及洗膜, 用dab显色试剂盒显色。
2 结果
2.1 pcr结果 以pmd18t/hbd4质粒为模板, d1和d2为引物, pcr反应扩增mhbd4 cdna, 得到近170 bp的目的片段, 与预期大小相符(图1)。
图1 hbd4成熟肽编码基因的pcr扩增结果（略）
fig 1 pcr amplification of mhbd4 cdna
1: 100 bp dna ladder; 2: product of pcr amplification.
2.2 原核表达载体pgex4t2/mhbd4的构建与鉴定 用bamh i和ecor i对重组表达载体pgex4t2/mhbd4进行双酶切鉴定, 与预期结果相符（图2）。测序结果表明, 重组表达载体pgex4t2/mhbd4插入片段的序列为预期的hbd4成熟肽的编码序列。
图2 重组质粒pgex4t2/mhbd4酶切鉴定结果（略）
fig 2 identification of recombinant plasmid pgex4t2/mhbd4 by endonuclease digestion
1: dna marker; 2, 3: recombinant pgex4t2/mhbd4 digested by bamh i/ecor i; 4: recombinant pgex4t2/mhbd4 without digestion.
2.3 融合蛋白gsthbd4的诱导表达及表达形式分析 将重组表达载体pgex4t2/mhbd4转入大肠杆菌dh5α中, 通过iptg诱导表达目的蛋白。表达产物行sdspage结果显示, 可见有新生蛋白条带出现, 表达量为菌体总蛋白的20%～30%, mr约为32000（其中gst的mr 26000, hbd4的mr 6000）, 同预期的相一致(图3)。将表达目的蛋白的工程菌裂解、 离心后, 取上清和沉淀进行sdspage。结果显示表达的蛋白大部分存在于沉淀中, 证明其以不可溶形式的包涵体表达为主, 尚有小部分以可溶性形式存在于上清中(图3)。
图3 融合蛋白gsthbd4的诱导表达及表达形式分析（略）
fig 3 sdspage analysis of the induced expression and expression form of gsthbd4 fusion protein
1: pgex4t2 without induction as a negative control; 2: pgex4t2 induced for 4 h; 3: pgex4t2/mhbd4 without induction; 4: protein marker; 5: debris of the bacteria lysate (insoluble gsthbd4); 6: supernatant of the bacteria lysate (soluble gsthbd4 ); 7: total protein of the induced bacteria as a positive control.
2.4 elisa检测兔抗gsthbd4抗体效价 取末次加强免疫后第10天的血清, 用间接elisa测定抗体的效价, 结果显示, 免疫前的兔血清未测出抗gsthbd4融合蛋白的抗体, 末次免疫后抗血清中抗体效价的滴度达1∶12800以上。
2.5 western blot检测兔抗gsthbd4抗体特异性 用制备的兔抗gsthbd4抗体对原核表达的蛋白进行western blot分析, 结果显示: 在mr约为32000处呈现特异性的结合条带, 而用免疫前兔血清代替一抗则未检测到任何条带。
3 讨论
防御素类抗菌肽作用机制独特, 不易使微生物产生耐药性, 并且因其源于机体本身而具有非常高的安全性, 因此研究开发这类抗菌肽对于解决细菌耐药问题具有重要意义[6]。hbd4 是2001年joseramon对人染色体8p23的基因序列图谱分析时发现一种新的β防御素。hbd4 cdna 216 bp开放读框编码72个氨基酸的前肽、 50个氨基酸的成熟肽。国外研究表明, hbd4对金黄色葡萄球菌、 肉葡萄球菌、 绿脓杆菌、 大肠杆菌等具有抑制和杀灭作用, 特别是绿脓杆菌杀伤作用更强, 是已知其他防御素作用的6倍。hbd4表达于睾丸、 胃窦、 子宫等各种黏膜细胞和上皮组织, 与hbd3、 溶菌酶有协同作用,是单核细胞的趋化物[4]。因此hbd4对人体各个系统的先天免疫尤其是黏膜和上皮的防御起非常重要的作用。因而建立hbd4的原核表达系统, 在大肠杆菌中大量表达hbd4, 以及制备其相应的抗体, 从蛋白质水平检测hbd4的表达就十分重要。
我们利用pcr方法扩增出hbd4成熟肽编码序列mhbd4 cdna, 并重组于gst融合蛋白表达载体pgex4t2中, 经鉴定gsthbd4融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达。以表达gsthbd4融合蛋白作为抗原免疫家兔, 获得了具有较高抗体滴度及特异性的gsthbd4融合蛋白多克隆抗血清。gsthbd4融合蛋白的表达及其多抗制备的成功, 不仅克服了防御素多肽对宿主细胞的毒性作用, 可以方便地利用凝血酶切去其中的gst部分来获得hbd4纯品[7], 为进一步研究hbd4的生物活性及临床应用奠定基础; 而且融合蛋白本身也可增强hbd4免疫原性, 避免了应用传统方法制备抗血清时hbd4来源困难、 成本高的缺点。由于表达的gst蛋白是血吸虫蛋白抗原sj26 (schistosoma japonicum, mr26000), 与人体内的gst有较远的亲缘关系, 因此通过gst融合蛋白制备的抗血清就与人体内的gst没有交叉反应[8], 因此本研究获得的gsthbd4多克隆抗体可用于hbd4的组织分布的检测, 用于hbd4基因表达调节的实验研究。
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【关键词】 甲胎蛋白; 慢病毒; 基因转染; 树突状细胞
甲胎蛋白(alpha?fetoprotein, afp), 是一种重要的胚胎期及肝癌相关蛋白, 正常情况下新生儿出生后, afp表达即被关闭。但如果肝细胞发生癌变或发生化学或物理损伤时, afp基因又可重新表达。afp的表达量异常增高, 临床上可作为肝癌的一个诊断和预后指标。因此, 制备afp特异性的疫苗, 诱导针对afp的特异性的免疫反应, 可作为肝细胞癌治疗的一种新思路。树突状细胞(dendritic cell, dc)是体内功能强大的专职性抗原提呈细胞, 它能够高效的摄取、 处理抗原, 并将处理后的多肽呈递给静息型t细胞, 引起针对该抗原的特异性免疫反应。dc应用于肝癌免疫治疗是目前的研究热点, 用afp基因修饰dc, 一些方法被证实有效[1, 2]。本研究中, 我们构建了人afp慢病毒表达载体, 并应用该载体感染dc, 制备afp?dc疫苗, 为dc疫苗在肝癌中的临床应用提供实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料 慢病毒载体系统(tronolab)由中国科学院上海生化细胞所提供, 该病毒包装系统为四质粒系统, 组成为prsv?rev、 pmdlg?prre、 pmd2g、 pwpxl?mod2, 其中载体质粒pwpxl?mod2能表达绿色荧光蛋白(gfp)、 prsv?rev、 pmdlg?prre, pmd2g含有病毒包装所必须的元件。限制性内切酶bamhⅰ、 salⅰ购自takara公司。包装细胞293t细胞株购自atcc, 高感受态dh5α购自博大泰克公司, 转染用试剂trizol、 lipofectamine2000、 胎牛血清、 胰蛋白酶均购自invitrogen公司。il?4 、 gm?csf及tnf?α购自bioscience公司, afp肿瘤标志物检测试剂盒购自罗氏公司, 人肝癌细胞系hepg2为我科保存。
1.2 方法
1.2.1 pcr方法获取基因片段 根据afp基因信息设计基因合成引物: 上游引物5′端带有bamhⅰ切点, 下游引物5′端带有salⅰ切点, 上游5′?atttggatcccgccaccatgaagtg?ggtggaatcaat?3′, 下游5′?agacgtcgactcattaaactcccaaagcagc?3′。根据说明书用trizol试剂从人hepg2肝癌细胞中抽提总rna, 并利用rt?pcr 反转录成cdna, 以该cdna为模板利用上述引物做pcr扩增得到afp 基因片段 。pcr反应体系为: 模板1 μl , 10× la buffer 2 μl, dntp 2 μl, kod?plus 1.0 μl , primers 1.0 μl , h2o加至20 μl反应体系。pcr反应条件为: 94℃预变性5 min, 94℃变性45 s、 52℃退火45 s和68℃延伸90 s, 循环数35, 最后经72℃总延伸10 min 。目的产物经琼脂糖凝胶电泳分离、 回收, 获得afp基因片段。
1.2.2 慢病毒载体lenti?afp的构建及酶切鉴定 将pcr产物全部进行凝胶电泳后回收, 对慢病毒空载体pwpxl?mod2和pcr的回收产物分别用bamhⅰ和salⅰ进行双酶切, 酶切目的片段用dna 纯化试剂盒进行纯化, 再用t4连接酶将双酶切载体和目的基因片段进行连接反应。取5 μl连接产物转化入dh5α高效感受态细胞, 在含氨苄青霉素的lb 平板上37℃培养过夜。经pcr 及bamhⅰ和salⅰ双酶切鉴定后筛选出正确阳性克隆, 最后取一个正确连接的质粒送出测序进一步确认, 即lenti?afp。
1.2.3 lenti?afp慢病毒的制备 用磷酸钙法转染293t细胞制备lenti?afp慢病毒。将处于对数期生长的密度为2.5×106/l 293t细胞接种于的10 cm细胞培养皿中, 37℃、 50 ml/l co2培养箱内培养, 24 h后, 当细胞密度达60%～70%时转染。磷酸钙沉淀1 ml/10 cm盘, 向混合物(慢病毒质粒pwpxl?mod2?afp, 包装质粒, cacl2)中缓慢滴加入2×hbs 500 μl, 滴加同时注意混合以防止形成大颗粒的沉淀。静置20 min, 逐滴滴加入待转染的10 cm盘。转染8 h后吸去培养液, 用pbs洗去残余磷酸钙沉淀, 换新鲜培养液。72 h后收集细胞培养液, 室温3 000 r/min离心5 min, 收集上清并过0.45 μm的滤膜, 以除去混有的细胞或细胞碎片。将上清转入超速离心管中, 4℃、 26 000 r/min超速离心2 h。弃上清, 用约200 μl不含血清的dmem重悬病毒, -70℃储存待用。
1.2.4 慢病毒载体lenti?afp感染dc 抽取健康人外周静脉血200 ml , 肝素抗凝(20 u/ml 全血) , 用ficoll分离外周血单个核细胞(pbmc)。将所分离的pbmc 用含50 ml/l人ab血清、 100 u/ml青霉素、 100 mg/l链霉素、 30 μg/l l?谷氨酰胺、 1 000 u/ml il?4和500 u/ml gm?csf的rpmi1640液重悬成2×106细胞/l , 于6孔培养板中, 37℃、 50 ml/l co2培养箱中培养, 培养的细胞在贴壁50%时加入lenti?afp慢病毒(moi=10), 加入lentiegfp慢病毒(moi=10)作为对照组, 倒置荧光显微镜每隔12 h观察, 72 h后收集细胞, facs检测gfp阳性细胞数。培养第3 天, 半量补充il?4 和gm?csf。培养到第6天加入tnf?α (100 μg/l), 继续培养24 h后收集细胞。
1.2.5 rt?pcr检测afp的表达 分别收集2组感染后48 h和72 h的dc, 用qiagen rna minikit抽提细胞高纯度rna, 通过rt?pcr检测afp在mrna 水平的表达变化。
1.2.6 电化学发光法检测afp的浓度 分别收集2组慢病毒lenti?afp感染72 h的dc培养上清液10 μl, 用afp肿瘤标志物检测试剂盒, 通过e170电化学发光检测仪检测afp的分泌水平。
1.2.7 dc表型检测 收集培养7 d的dc, 将细胞密度调整为1×109/l, 取细胞悬液100 μl/管, 分别加入cd80?fitc、 cd86?pe、 cd83?fitc、 hla?dr?fitc、 和cd1a?pe单克隆抗体各15 μl, 混匀后置室温下暗室反应30 min, 加pbs缓冲液, 1 000 r/min 5 min离心洗涤后, 以10 g/l多聚甲醛固定备作流式细胞仪检测。cell quest软件进行分析。
1.2.8 统计学分析 全部数据以x±s表示, 应用spss11.5 统计软件分析, 各实验组之间的比较采用t检验。p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 pcr方法获取基因片段 取rt?pcr扩增的产物5 μl进行琼脂糖凝胶电泳, 显示在1 830 bp处有扩增条带, 片段大小与理论预期值一致(图1)。
.2.2 慢病毒载体lenti?afp的构建及酶切鉴定 构建出的慢病毒载体lenti?afp用bamh i/sal i双酶切, 取酶切产物10 μl, 琼脂糖凝胶电泳分别在大约9.8 kb和1 830 bp 处可见一条带。测序结果进一步证实克隆的序列完全正确(图2)。
2.3 lenti?afp慢病毒的制备 lenti?afp感染293t细胞后, 在倒置显微镜下观察, 可见转染12 h后的细胞明显增大、 呈球形, 细胞核变大, 变圆, 贴壁能力下降而易脱落。感染24 h、 48 h后 , 在倒置荧光显微镜下观察, 发生同源重组的病毒, 可见报告基因绿色荧光蛋白( gfp) 的表达(图3)。
2.4 lenti?afp慢病毒感染dc lenti?afp慢病毒以moi=10感染dc, 48 h、 72 h分别在荧光倒置显微镜下可观察到被感染的阳性细胞有绿色荧光蛋白表达(图4)。通过流式细胞仪检测, 感染效率为78.91%左右。
图3 慢病毒载体lenti?afp混合质粒转染293t细胞24 h(a)和48 h(b) gfp荧光照片(×100)
图4 慢病毒载体lenti?afp感染dc(moi=10)48 h(a)和72 h(b)的荧光照片(×100)2.5 rt?pcr检测afp的表达 用lenti?afp感染dc 24 h和48 h 后, 提取总rna并反转录成cdna, 进行pcr检测afp的表达, 结果均得到一条1 830 bp 左右的条带, 表明有相应的mrna转录, 而对照组为阴性(图5) 。
2.6 电化学发光法检测afp的浓度 通过e170电化学发光检测仪, 检测到lenti?afp感染dc组afp的含量为230.8 μg/l, 而对照组未检测到afp的表达。
2.7 dc的表型特点流式细胞仪检测 facs分别检测lenti?afp转染dc 7 d后的表型结果显示cd80?fitc、 cd86?pe、 cd83?fitc、 hla?dr ?fitc和cd1a?pe表达量, 相对于对照组(lenti?egfp感染的dc)无统计学意义(p>0.05, 表1)。 表1 dc免疫表型分析
3 讨论
将dc疫苗回输人体内治疗肿瘤, 是肿瘤治疗的一个重要发展方向。目前国内外已大量开展这方面的研究[3, 4]。主要的方法有在体外dc培养中加入肿瘤匀浆或纯化蛋白, 或直接将抗原通过质粒或病毒载体导入dc, 输入体内后激活cd8+和cd4+ t细胞[5]。afp?cdna 真核表达载体体外转染dc的研究已取得明确的进展[6]。以携带肿瘤特异性抗原基因的病毒载体感染dc, 可使抗原基因在dc中高表达, 提高其表面共刺激分子的表达, 刺激机体产生特异性的抗肿瘤免疫反应。病毒载体感染效率的高低, 往往决定诱导特异性免疫反应的强弱, 是抗原提呈和表达的关键。慢病毒载体不仅能感染不分裂细胞, 无插入致突变性, 且具有转染率高, 免疫反应小的特点。doi等[7]用带有绿色荧光蛋白序列的慢病毒进行的动物实验表明绿色荧光蛋白在动物体内、 外均可长期高表达, 未发现任何毒性反应。negre等[8]报道了慢病毒载体感染dc, 当moi为10时, 不成熟及成熟dc 的感染率分别为10% 和32% , 被感染dc 的表型与正常dc 基本无异。evans等[9]以慢病毒载体转染外周血cd34+ 干细胞来源的dc后能高表达目的抗原gfp, 且仍保持dc表型特征, 如高表达的cd1a、 cd83、 cd80和hla?dr等。本研究以人hepg2肝癌细胞的cdna为模板扩增得到afp 基因片段, 并将该片段插入慢病毒载体基因片段中, 成功构建了lenti?afp重组慢病毒载体。经酶切、 pcr及dna序列分析鉴定证实插入片段为afp基因。为了提高lenti?afp重组慢病毒载体的感染效率, 我们将该病毒载体进行了包装处理, 包装的慢病毒具有良好的感染性, 可以在293t细胞中形成病毒颗粒。将包装好的携带afp基因的慢病毒感染dc, 经荧光检测和rt?pcr 法鉴定证实dc内存在有转染的afp基因; 经facs检测慢病毒感染率可达78.91%; 用e170电化学发光检测到lenti?afp慢病毒感染dc中afp的表达情况, 结果发现dc中afp的含量高达230.8 μg/l, 说明lenti?afp慢病毒感染dc后, afp可在dc中高效表达; 检测两组dc表型表达量无显著性差异, 说明重组慢病毒lenti?afp感染dc后可以表达afp, 且不会明显诱导dc凋亡, 不影响dc的表型。研究结果表明, 我们构建的含人afp基因的慢病毒能够体外感染dc, 感染效率高, 较一般的慢病毒载体感染dc的感染率高出2倍以上, 并且成功表达目的基因afp。应用afp基因感染dc制备的lenti?afp ?dc疫苗有望成为肝癌的一种免疫治疗手段, 为进一步研究dc疫苗在肝癌中的临床应用创造了条件。
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【摘要】
目的: 探讨负载人脐静脉内皮细胞（HUVEC）抗原的DC疫苗诱导小鼠对宫颈癌U14的特异性免疫反应。方法: 原代培养和鉴定人HUVECs， 制备抗原， 负载树突状细胞（DC）， 免疫小鼠， 免疫结束后1周小鼠皮下注射小鼠宫颈癌U14细胞， 观察肿瘤生长大小、 检测免疫后小鼠脾细胞体外CTL效应、 表面CD3+CD8+百分率和血清抗体滴度， 通过细胞免疫组化和Western blot血清特异性反应分析。结果: 经免疫组化鉴定成功培养出纯度高的HUVECs， 抗原负载DC并注射BALB/c小鼠后， PBS组肿瘤生长最快， DC组和HUVECDC组肿瘤也有生长， 但生长较慢， 在2周后HUVECDC组肿瘤消失， 3周后DC组肿瘤消失。小鼠脾细胞体外CTL结果显示HUVECDC组有明显的特异性杀伤HUVEC的作用。CD3+CD8+百分比提示HUVECDC组细胞毒性T细胞比例较其他两组高。小鼠血清抗体滴度示有抗体产生， 免疫组化检测示组与HUVEC有特异性抗原抗体反应， Western blot显示在相对分子质量（Mr）130 000和220 000处有特异性条带。结论: 负载人HUVECs抗原的DC疫苗和DC疫苗对小鼠宫颈癌U14有抑制作用， HUVECDC疫苗诱导了小鼠的细胞和体液免疫， 并诱导了针对HUVECs细胞中的某些抗原的应答， 这些抗原可能是整合素αν和VEGFR2。
【关键词】 人脐静脉内皮细胞抗原; 树突状细胞; 小鼠宫颈癌; 特异性免疫反应
［Abstract］AIM: To explore the specific immunity of dendritic cell (DC) vaccine loading human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) antigen.against U14 cervical cancer of mice. METHODS: Primary HUVECs were cultured， identified and made into antigen. The BALB/c mice were immuned with DCs loading HUVEC antigen 4 times a week. One week after last vaccination， U14 cervical cancer cells were injected subcutaneously into the mice. The tumor size， CTL response of spleen lymphocytes in vitro， the percentage of CD3+CD8+ surface markers of spleen lymphocytes， and the titer of serum antibody were detected. The specific immunity was examined by immunocytochemistry and Western blot. RESULTS: HUVECs with high purity were successfully cultured and by identified by immunocytochemistry and RTPCR. After the vaccine was injected into mice， the tumors of mice in PBS group grew faster than the those in other groups. The tumors of mice in HUVECDC groups grew slowly and disappeared after 2 weeks and The tumors of mice in DC group disappeared after 3 weeks. The CTL response of spleen lymphocytes in vitro showed that HUVECDCT cells could kill HUVEC cells. The percentage of CD3+CD8+ surface markers of spleen lymphocytes in HUVECDC group was higher than that in other groups. The titer of serum antibody was 1∶800. immunocytochemistry analysis indicated HUVECDC group had specific antigenantibody reaction to HUVECs through and Western blot analysis revealed there were specific bands at 130 KDa and 220 KDa. CONCLUSION: HUVECDC vaccine and DC vaccine can inhibit the tumor growth of U14 cervical cancer of mice. The special cellular and humoral immunity are induced by HUVECDC vaccine. Furthermore， some antigens in HUVECs maybe have special immune reaction with integrin α ν and VEGFR2.
［Keywords］human umbilical vein endothelial cell antigen; dendritic cell; cervical cancer of mouse; specific immunity response
肿瘤血管的生成是肿瘤生长和转移的必要条件。在成年人， 血管生成处于相对静止状态， 而在缺氧的情况下， 肿瘤细胞可以通过分泌内皮细胞生长因子打破此状态形成新血管， 肿瘤新生血管与静止期的正常血管的区别就在于其表达血管生成相关抗原［1］， 虽然， 靶向自身血管生成的单克隆抗体(mAb)和人工合成分子在动物实验中抑制了肿瘤的生长， 但由于其半衰期短， 作用单一， 往往需要联合和长期治疗， 而且特异性高的抗原分子仍有待分离。2000年， Wei等［2］运用异种血管内皮细胞疫苗进行抗肿瘤血管治疗取得了很好的疗效， 但Yoneyama等［3］研究发现在治疗过程中有的效果则不是很理想， 为了增强疫苗的效果， 我们假设用负载异种血管内皮细胞人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell， HUVEC）抗原的树突状细胞（dendritic cell， DC）免疫小鼠， 观察其诱导小鼠对宫颈癌U14的特异性免疫反应， 并初步研究其机制。
1 材料和方法
1.1 材料
内皮细胞培养基（ECM培养基）购自ScienCell公司， DMEM购自Gibco公司， 胎牛血清购自天津TBD公司， 胰蛋白酶购自Amresco公司， 兔抗人vWF抗体为Santa Cruz公司产品， 兔抗人CD144抗体为Cell Signaling公司产品， 即用型DAB免疫组化试剂盒、 浓缩型DAB试剂盒， 牛血清白蛋白、明胶， 考马斯亮蓝G250均购自Sigma公司， TRIzol购自Invitrogen公司， 小鼠GMCSF购自杭州隆基公司， 小鼠IL4 、 IL2购自Peprotech公司， CCK8 kit购自日本株式会社同仁化学所， HRPIgG购自武汉博士得公司， FITCCD3ε和PECD8α单克隆抗体（mAb）购自Biolegend公司， BALB/c小鼠30只（6～8周龄， 体质量16～18 g， 购自郑州大学动物中心， 许可证号: SCXK豫2005～0001）， 小鼠宫颈癌U14瘤株购自中国医学科学院实验动物研究所。
1.2 方法
1.2.1 原代人HUVECs分离培养
健康孕妇产后立即取新生儿脐带置入生理盐水中， 长约15～20 cm， 4 h之内行HUVECs分离培养。用含青、链霉素生理盐水冲洗脐静脉至冲洗液呈无色清亮时， 向脐静脉内灌注2.5 g/L胰蛋白酶， 置细胞培养箱中10～15 min后收集消化液， 1 200 r/min， 离心8 min， 细胞重悬于ECM中， 接种于明胶包被的培养瓶中， 置37℃、50 mL/L CO2培养箱中培养。24 h后弃培养液， PBS液轻洗1次， 除去红细胞及未贴壁细胞， 加ECM继续培养， 2～3 d 换液1次， 2～3 d可长成单层细胞。生长汇合至80%后， 用2.5 g/L胰蛋白酶消化， 1∶2传代继续培养2～3 d换液1次。
1.2.2 免疫细胞化学检测vWF、CD144鉴定原代人HUVECs
将人HUVECs细胞接种96孔板， 过夜培养。40 g/L多聚甲醛固定30 min。vWF组需加2.5g/L Tritonx100透膜。然后加H2O2(300 mg/L H2O2∶甲醇=1∶50)， 室温30 min， BSA封闭30 min。吸去BSA， 加兔抗人vWF和CD144抗体， 盖底即可。4℃过夜。第2天， 吸去一抗， 加生物素化抗羊抗兔IgG二抗， 室温20 min， 加SABC室温20 min， 加DAB 30 min， 显微镜观察染色程度。苏木精染色1～2 min， 用相差倒置显微镜拍照， 再用Biosens Digital Imaging System灰度扫描仪扫描以检测vWF和CD144抗原水平。
1.2.3 原代人HUVECs抗原的制备
收集培养的人HUVECs， 调整密度1×1010/L， PBS重悬， 液氮冷冻5 min后立即放入37℃水浴中5 min， 反复4次。4℃， 10 000 g， 离心30 min， 收集上清。按Brad～ford蛋白定量法， 收集的上清取50 μL与考马斯亮蓝950 μL混匀， 静置3 min， 用UNICOUV2102PCS系统分别检测抗原的吸光度（A）， 然后根据标准曲线进行浓度计算。
1.2.4 小鼠骨髓DCs的培养和鉴定
参照文献方法［4］， 略有改动。拉颈处死BALB/c小鼠， 无菌剥离股骨和胫骨。用注射器将骨髓冲出， 离心收集骨髓细胞， 加入预温的TrisNH4CL裂解红细胞， 然后用含100 mg/L FCS的RPMI1640完全培养液（含rmGMCSF（10 μg/L）和rmIL4（5 μg/L）调整细胞密度为3×109/L， 以1 mL/孔加入接种于24孔培养板。置37℃、 50 mg/L CO2的孵箱中培养48 h后弃去悬浮细胞， 隔日半量换液， 每日用相差显微镜观察细胞的生长和形态变化。收集培养至第7天的DC， 调细胞密度为2×108/L， 分别加入1 μL FITC标记的CD86和PE标记的CD11a抗小鼠mAb。设立空白对照， 4℃避光反应30 min。洗涤后上流式细胞仪检测。
1.2.5 负载人HUVECs抗原的DCs疫苗免疫小鼠
DCs培养第3天， 加入人HUVECs抗原100 mg/L， 继续培养至第6天， 加入脂多糖， 隔日半量换液， 第8天， 用胰酶消化法收集DCs， PBS洗2次， 重悬调密度5×109/L， 此为HUVECDC疫苗， 直接BALB/c小鼠皮下注射。BALB/c小鼠分为3组: PBS组， DC组， HUVECDC组。每组10只。共免疫4次， 每周1次， 最后1次免疫后7 d， 皮下注射小鼠宫颈癌U14细胞1.5×106/只， 同时， 乙醚麻醉各组小鼠摘眼球取全血， 室温放置1 h， 4℃过夜， 收集上清， 4℃保存作为免疫小鼠血清。触及肿瘤后每3 d测量肿瘤大小， 称量小鼠重量， 游标卡尺测量肿瘤大小， 肿瘤体积V (mm3) = 0. 5ab2， a为长径(mm)， b为短径(mm) 。待1只小鼠死亡后全部处死小鼠取出肿瘤， 称重， 测其体积， 观察疫苗对小鼠U14细胞皮下肿瘤的抑制作用。
1.2.6 诱导小鼠对UI4细胞的细胞和体液免疫应答
（1）免疫小鼠脾淋巴细胞分离: 拉颈处死各组小鼠后无菌取脾脏， 研磨成单细胞， 经孔径200 μm尼龙筛过滤， 用Dhank’s液2.5 mL重悬， 沿管壁轻轻加至4 mL小鼠淋巴细胞分离液上， 1 700 r/min， 离心15 min， 取白膜层， 用TrisNH4Cl裂解红细胞， 经尼龙毛柱洗脱后用含100 mg/L小牛血清RPMI1640重悬。(2)荷瘤后CD3和CD8表达: 各组脾淋巴细胞用100 μL 100 mg/L小牛血清RPMI1640重悬， 加FITC标记的CD3εmAb 1μL和PE标记的CD8αmAb 2.5μL， 4℃避光反应30 min， 100 mg/L小牛血清的PBS洗2次， 1 mL重悬上流式细胞仪检测。(3)ELISA检测抗体滴度: 取96孔可拆式酶标板， 将HUVEC总蛋白用包被缓冲液稀释(3 mg/L)， 加入板孔中(100 μL/孔)， 4℃包被过夜。每组设5个复孔， 弃包被液， 加封闭液， 37℃封闭2 h。弃封闭液， 用洗涤液洗6次， 每次2 min。加入稀释液稀释的1∶50， 1∶100， 1∶200， 1∶400， 1∶800， 1∶1 600， 1∶3 200和1∶6 400抗血清（免疫小鼠血清）， 并设阴性对照组（只加PBS）， 40 μL/孔， 37℃孵育1 h。弃去抗血清， 用洗涤液洗6次， 每次2 min。加入HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗， 稀释液稀释（1∶10 000）， 50 μL/孔， 37℃孵育30 min。弃去二抗， 用洗涤液洗6次， 每次2 min。加入底物显色液(TMB: A+B混匀)， 100 μL/孔， 37℃， 显色10～20 min。加入终止液， 50 μL/孔， 终止反应。酶标仪读数， 测定每孔A450值。空白对照调零， P/N≥2.1， 判为阳性(P: 阳性抗原孔A值， N: 阴性抗原孔A值)。
1.2.7 诱导小鼠对UI4肿瘤血管的特异性免疫应答
（1）脾淋巴细胞CTL实验: 各组脾淋巴细胞用100 μL 100 mg/L小牛血清RPMI1640重悬， HUVECs常规培养， 胰酶消化后作为靶细胞。以脾淋巴细胞: 靶细胞=50∶1和25∶1将细胞种于96孔板， DC和PBS组作对照， 37℃， 50 mg/L CO2共培养24 h， 在最后4 h， 加入CCK810μL/孔， 用酶标仪检测A450值。(2)免疫细胞化学检测: 将HUVEC细胞接种于96孔板上， 培养过夜， 40 g/L多聚甲醛固定30 min。然后加H2O2(300 mL/L的H2O2∶甲醇=1/50)， 室温30 min， BSA封闭30 min。吸去BSA， 加入免疫小鼠血清（1∶10）为一抗。4℃过夜。第2天， 吸去一抗， 加羊抗小鼠HRPIgG二抗， 室温20 min， 加DAB 30 min， 显微镜观察染色程度。用相差倒置显微镜拍照， 再用Biosens Digital Imaging System灰度扫描仪扫描分析。(3)Western blot检测VEGFR2和整合素αν: 提取HUVEC细胞总蛋白， 按考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测总蛋白含量， -80℃储存备用。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳: 制备100 g/L分离胶和50 g/L的浓缩胶， 取待测的样品各50 μg及蛋白分子质量标准上样电泳。采用半干式电转移法。将蛋白转移至PVDF膜上。室温封闭（50 g/L BSA）3 h后分别加入免疫小鼠血清作为一抗(1∶25)， 4℃过夜。TBST洗膜3次 ， 加入羊抗小鼠HRPIgG二抗， 室温孵育1 h。TBST 洗膜后， ECL显色， 暗室压片成像。GelDoc紫外凝胶成像分析系统计算各条带的灰度值(Quantity One 1D Analysis Software)。
1.2.8 安全性观察
实验过程中， 每周称小鼠体重， 观察小鼠皮毛色泽， 食欲、 粪便及活动变化。小鼠处死后观察肝、肺、肾等脏器变化。
1.2.9 统计学分析
采用SPSS10.0统计软件包， 所有资料均为计数资料， vWF、 CD144、CD31免疫组化和抗原浓度数据分析用x±s表示， 分别采用t检验和单因素方差分析， 以P
2 结果
2.1 原代人HUVECs的形态学观察
多呈小三角形、短梭形， 2～3 d汇合成单层， 细胞边界清楚， 胞质丰富， 胞核呈圆形或椭圆形， 偶见双核， 密集处呈铺路石状镶嵌排列， 稀疏处为短梭形。传代培养的细胞形态饱满， 伸展呈长梭形， 漩涡状排列生长（图1）， 细胞贴壁牢固; 细胞传至第5代出现管腔样结构。
2.2 人HUVECs标志vWF、CD144的表达
DAB染色以胞质着棕黄色颗粒为主的为vWF阳性细胞（图2A）; DAB染色以胞膜着棕黄色颗粒为主的为CD144（图2B）。
2.3 小鼠骨髓源DCs的形态
培养前48 h尽量少看细胞， 第3天， 可见部分细胞较种板时变大， 部分细胞贴壁， 呈长梭形（图3A）， 第5天， 几乎80%细胞贴壁， 有的细胞可见3～4个突起， 第7天， 部分细胞变圆， 但仍可见较多细胞贴壁， 可见集落形成， 此为成熟的DCs（图3B）。
2.4 小鼠骨髓源DCs表型的鉴定
FCM检测表明， 培养成熟的小鼠骨髓源DCs表达CD86和CD11a， 阳性率分别为65.77%、 37.51%。
2.5 免疫小鼠后肿瘤生长情况
HUVECDC疫苗免疫小鼠4次后7 d皮下接种小鼠宫颈癌U14细胞1.5×106/只， 分别在第5天可以在PBS组、DC组触及肿瘤， 肿瘤绿豆大小， 而HUVECDC疫苗组可触及小米粒大小肿块， 第8天， PBS组肉眼可看到肿瘤， 而DC组和肿瘤HUVECDC疫苗组无明显变化， 2周后， PBS组肿瘤体积3.375±0.335 cm3， 而HUVECDC疫苗组肿块消失， DC组肿瘤也逐渐缩小肿瘤体积0.06075±0.268 cm3， 于3周后消失。PBS组瘤体逐渐增大， 多在50 d左右破溃， 小鼠体重变化不大， 但极度消瘦， 生存期约(57.33±2.06) d。
2.6 小鼠对UI4细胞的细胞和体液免疫应答
2.6.1 免疫小鼠荷瘤后脾CD3和CD8T淋巴细胞亚群变化
接种肿瘤后第1只小鼠死亡后， 各组取1只小鼠处死后取脾脏， 分离脾脏淋巴细胞， 流式细胞术检测CD3+和CD8+T淋巴细胞百分率， 结果接种肿瘤后HUVECDC疫苗组和DC疫苗组CD3+和CD8+较PBS组明显升高， 以HUVECDC疫苗组最高(P
2.6.2 ELISA检测抗体滴度
HUVECDC组免疫小鼠血清经过间接ELISA法测定滴度约1∶800， 为阳性， DC组和PBS组为阴性。
2.7 诱导小鼠对UI4肿瘤血管的特异性免疫应答
2.7.1 脾淋巴细胞CTL实验
将各组脾淋巴细胞加入CCK8 10μL/孔， 用酶标仪检测A450值， 重复3次， 取平均值。结果显示脾淋巴细胞: 靶细胞(HUVECs)=50∶1和25∶1的两组细胞的HUVECDC疫苗组明显有杀伤HUVEC效应（P0.05）。
2.7.2 免疫小鼠血清检测
进行细胞组化和Western blot检测后发现， HUVECDC组免疫血清与HUVEC细胞呈阳性反应， 在Mr 220 000和130 000处可见阳性条带， 而DC组和PBS组则呈阴性反应， 且没有条带（图5）。
2.8 安全性观察
实验过程中， 各组小鼠体重无统计学意义（P>0.05）， 实验后期， PBS组小鼠出现皮毛干燥、杂乱、活动减少， 食欲、 粪便无明显变化。HUVECDC组和DC组小鼠皮毛、食欲、粪便及活动无明显异常。断尾取血后， 愈合好， 无明显的出血倾向。处死后观察肝、肺、肾、脾等脏器无明显变化。因此， 本疫苗具有良好的安全性。
3 讨论
肿瘤血管生成是一个多步骤的复杂过程。现在认为肿瘤血管形成是促血管生成因子和血管生成抑制因子的平衡被打破的结果。肿瘤血管生成是多因子参与的过程， 在肿瘤发展的不同阶段发挥主导作用的调控因素不同［1］， 因此， 单纯阻断血管生成的某个环节所致的抑瘤作用必定有限。而运用整个血管内皮细胞做抗原， 则可避免单一抗血管治疗的方法的缺陷， 起到更好的治疗效果［4-6］。打破肿瘤血管生成的免疫耐受是抗肿瘤血管的主要治疗方法之一， 但治疗过程中仍然有的病例效果不理想， 改变抗原负载形式可能提高肿瘤治疗效果。
机体对肿瘤细胞产生免疫耐受的主要原因是肿瘤细胞抗原性弱、不表达MHCⅡ类分子、共刺激分子和淋巴细胞黏附所需的分子， 因此T细胞无法识别和激活［7］。DC则在主动摄取肿瘤抗原后， 提供和增强T细胞激活的第一、二信号， 使T细胞有效的活化， 其中通过MHCI类分子途径主要是激活CD8+T细胞形成CTL， 而MHCⅡ类分子途径主要是激活CD4+ T形成Th1细胞［8］， 因此利用DC可成功的打破机体免疫耐受， 我们的实验结果也证实了这一点， 单纯DC免疫组在接受肿瘤细胞注射后， 激活CD8+T细胞， 同样也抑制了肿瘤的生长。
小鼠宫颈癌U14是可移植的未分化鳞状细胞癌， 是实体瘤， 可以腹腔和皮下接种传代， 恶性程度高， 目前已广泛用于抗肿瘤药物筛选、 肿瘤免疫等领域的研究。
实验结果从宏观上看， HUVECDC组和DC肿瘤生长较慢， 而且逐渐消失， 可以称为“tumor free”［3］， 从脾CD3CD8T淋巴细胞亚群变化、 体外脾细胞CTL、 免疫血清组化和Western blot检测结果和Wei等［2］的结果相一致， 整个实验过程中， 小鼠无明显出血倾向， 疫苗对小鼠皮毛、 食欲、 粪便及活动无明显影响。
增殖活跃的肿瘤血管内皮细胞表达相关基因有整合素αν［9］和VEGFR2［10］， 在静息期的内皮细胞表面呈低水平表达， 而在体外培养的增殖旺盛原代HUVECs有整合素αν和VEGFR2基因表达。整合素ανmAb和VEGFR2疫苗均可有效抑制肿瘤生长。我们的实验结果也诱导了小鼠体内特异的细胞和体液免疫， 而起到了抗肿瘤血管的作用。这种抗肿瘤血管生成和DCs的抗原提呈功能相结合的方法可以称为一种新的预防肿瘤生成的方法， 有望将这种方法运用于人类， 这也是我们的研究目标。
参考文献
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［3］Yoneyama S， Okaji Y， Tsuno NH， et al. A study of dendritic and endothelial cell interactions in colon cancer in a cell line and small mammal model［J］. Eur J Surg Oncol， 2007， 33(10): 1191-1198.
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［8］Roitt I(周光炎 主译).免疫学［M］. 北京: 人民卫生出版社， 2002: 105-118.
【摘要】 目的: 构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性噬菌体抗体库， 搭建人源性抗体制备的技术平台， 为小儿呼吸道合胞病毒感染发病机制的研究、 诊断、 治疗和预防提供新的有效途径。方法: 从52例呼吸道合胞病毒感染患儿外周血淋巴细胞中提取总RNA， 并逆转录为cDNA。用PCR扩增轻链和重链Fd段（即重链的可变区和第一恒定区）基因， 并将扩增的轻链和重链基因片段克隆于pComb3x噬粒载体， 电转化XL1Blue大肠杆菌， 经辅助噬菌体M13K07超感染后构建成Fab段噬菌体抗体库。对此抗体库双酶切进行鉴定， 并用呼吸道合胞病毒颗粒作抗原进行初步筛选。结果: 经过重轻链基因的重组， 成功构建一免疫噬菌体抗体基因库， 共有2.6×106个不同的克隆菌， 其中70%的克隆均含有轻链和重链Fd 基因。因此， 所构建的噬菌体抗体库的库容量为1.8×106， 经初步筛选， 抗体库得到了不同程度的富集。结论: 利用基因重组技术和噬菌体展示技术， 成功构建小儿呼吸道合胞病毒感染患者人源性免疫噬菌体抗体库， 为进一步的研究奠定了基础。
【关键词】 抗体库; 噬菌体展示技术; Fab抗体; 呼吸道合胞病毒; 儿童
随着分子生物学的发展， 基因工程抗体技术的出现， 尤其是噬菌体抗体库技术， 为各种不同免疫原人源性抗体的制备提供了新途径， 成为抗体工程领域革命性的进展［1］。我们以52例呼吸道合胞病毒感染患儿外周血淋巴细胞作为基因来源， 成功地构建了一个人源性Fab段免疫噬菌体抗体库， 并对其进行了初步鉴定， 为研制诊断、 治疗和预防小儿呼吸道病毒感染的基因工程药物奠定了基础， 同时也将解决鼠源性抗体在临床应用中存在的不足。
1 材料和方法
1.1 材料 选取52例经ELISA法检测呼吸道合胞病毒IgM和/或IgG抗体阳性的患儿， 每例患儿抽取血液2 mL， 共约100 mL。噬粒载体 pComb3x（含氨苄青霉素抗性基因）， 大肠杆菌菌珠 XL1Blue（带四环素抗性基因）， 辅助噬菌体M13K07(具卡那霉素抗性基因)由第四军医大学李郁博士惠赠。焦碳酸二乙酯购自AMRESCO公司， TRIzol购自Invitrogen公司， RNA逆转录试剂盒购自Fermentas公司， Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司， 限制性内切酶Spe I、 Xho I、 Sac I、 Xba I购自Promega公司， 呼吸道合胞病毒Long株（RSVLong）， 由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 淋巴细胞的分离和总RNA的提取 用淋巴细胞分离液分离约100 mL外周血淋巴细胞， 用TRIzol法提取总RNA， 取适量进行甲醛变性胶电泳并用分光光度计测A值以鉴定RNA的质量。
1.2.2 轻链基因和重链Fd段基因的扩增 PCR引物设计及扩增参照文献［2］， 共23条引物， 由Generay Biotech 公司合成。按RNA逆转录试剂盒中的说明， 将总RNA逆转录为cDNA， 以其为模板， PCR扩增轻链及重链Fd段基因， 扩增条件为: 94℃ 50 s， 55℃ 50 s， 72℃ 1 min， 共30个循环; 并分别引入酶切位点Sac I+Xba I和Spe I+Xho I。将全部抗体基因产物经琼脂糖凝胶电泳回收。
1.2.3 轻链基因库和Fab段抗体基因库的构建及鉴定 轻链基因的扩增产物经Sac I和Xba I双酶切后回收， 与经同样酶切回收的pComb3x载体片段相连接， 并电转化E.coli XL1Blue感受态菌， 构建轻链基因库。取适量菌液稀释后， 接种于SOBAG琼脂平板（含氨苄青霉素100 mg/L， 葡萄糖20 g/L）， 以测定转化率， 并随机挑选10个单克隆菌， 酶切鉴定轻链库的重组率。其余菌液扩大培养后提取质粒， 经Spe I和Xho I双酶切， 回收带有多样性轻链基因的载体大片段; Fd段重链基因也以Spe I和Xho I双酶切后回收， 用T4 DNA连接酶将回收的两种基因片段连接， 将连接产物电转化E.coli XL1Blue， 其余构建Fab段抗体基因库步骤同轻链基因库的构建。
1.2.4 Fab段噬菌体抗体库的构建及初步筛选 将Fab段抗体基因库的菌液转入SBA+T+液体培养基（含100 mg/L氨苄青霉素和10 mg/L四环素）中37℃振荡培养2 h， 然后按1×1012pfu/100 mL加入辅助噬菌体M13K07和卡那霉素（终浓度70 mg/L）， 于37℃培养过夜。次日， 将扩大培养的菌液于4℃以4 000 r/min离心15 min， 加入40 g/L PEG8000沉淀， 用含有10 g/L BSA和100 g/L甘油的PBS重悬沉淀， 瞬时离心， 取上清即为噬菌体抗体库。用纯度为1×1015/L的Long株RSV颗粒作抗原进行初步筛选， 将RSV包被于96孔板于4℃过夜， 次日， PBS洗涤后， 用30 g/L BSAPBS封闭， 于37℃孵育1 h。将上述噬菌体抗体库溶液加入96孔板于室温孵育1 h后倒空， 用含0.5 mL/L Tween的PBS洗涤10次后， 再用PBS洗涤10次。加入对数期生长的E.coli XL1Blue和M13K07， 于37℃孵育2 h以让其再感染和进行噬菌体挽救， 并测定抗体库的滴度， 其测定方法为: 将抗体库按比例稀释后取1 μL与100 μL对数期生长的XL1blue菌液混合， 37℃缓慢振荡反应20 min， 加入Top Agar 3 mL， 铺至37℃预热不含抗生素的LB琼脂平皿， 37℃培养过夜， 计算平皿上噬斑形成单位（pfu）。重复上述淘筛过程3遍。每轮筛选完毕后均按如下过程对抗体库进行ELISA检测: 将100 μL RSV包被于96孔板4℃过夜; PBS洗涤后于每孔加入10 μL待测噬菌体抗体， 并用含20 g/L脱脂奶的PBS于室温封闭2 h; 加入HRP抗M13抗体孵育1 h; 用PBST洗涤5次， 加入ABTS置室温30 min后测A值。
2 结果
2.1 淋巴细胞的分离和总RNA的提取 提取的总RNA凝胶电泳显示条带完整， A260/A280值为2.03， 说明提取的总RNA质量较好(图1)。
图1 总RNA凝胶电泳分析
2.2 轻链基因和重链Fd段基因的扩增 取适量轻链基因和重链Fd段基因的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳， 在约700 bp处均可见扩增条带， 与预期的大小相符（图2）。
2.3 轻链基因库和Fab段基因库的构建及鉴定 从轻链基因库14 mL转化产物中取1 μL稀释后铺于琼脂平板上， 共长出205个单克隆菌落， 从而推算转化子数为205×14×103=2.9×106; 随机挑取的10个菌落的质粒经Sac I和Xba I双酶切后电泳， 其中有8个可得到700 bp左右DNA片段， 为轻链基因插入片段， 重组率为80％， 则其库容量为2.9×106×0.8=2.3×106。用同样的方法， 得到Fab抗体基因库转化子数为2.6×106， 随机挑取的13个克隆中有9个酶切出Fd段DNA片段， 则重组率为9/13(约70％)（图3）， 则其库容量为2.6×106×0.7=1.8×106。
2.4 Fab段噬菌体抗体库的构建及初步筛选 以RSV作为抗原对噬菌体抗体库进行了3轮“吸附洗脱扩增”的筛选， 测定抗体库滴度分别为1.2×105、 1.8×106、 9.4×106 pfu， 显示了明显增加的趋势， 第3轮比第1轮增加了78倍， 说明特异性噬菌体得到了富集; 每轮均经ELISA检测， A值分别为0.23、 0.56、 1.05， 随着筛选轮数的增加而逐渐增加。
3 讨论
呼吸道合胞病毒感染在儿科很常见， 每年均有暴发， 发病率高， 90%在2岁前均感染过RSV［3］， 但目前尚无理想的抗病毒药物。1891年， Emil von Behring首次将来自动物的白喉抗毒素血清用于白喉感染患儿的治疗取得较为满意的疗效， 从而为抗体用于感染性疾病的治疗奠定了基础［4］。杂交瘤技术的创立， 为mAb用于感染性疾病的治疗提供了可能， 但是鼠源性的mAb因HAMA反应等副作用而受限于临床应用［5］。噬菌体抗体库技术的出现， 首次为获得完全人源性的mAb提供了一条佳径。噬菌体展示技术是一种分子多样性技术， 它让大量不同的多肽或蛋白展示在丝状噬菌体的表面［6］。针对几乎任何抗原的高亲和力特异性抗体均可在噬菌体抗体库中筛选出， 使mAb用于肿瘤、 感染性疾病等的诊断、 治疗成为可能［7， 8］。与费时而繁杂的mAb技术相比， 噬菌体抗体有稳定的基因来源， 可以通过DNA重组， 迅速而经济地制备各种人源性抗体而无动物免疫原性， 从而适合体内诊断与治疗［9］。
有两种途径可以获得高亲和力的抗体， 一种是构建大容量的天然抗体库， 另外就是构建免疫抗体库［10］。从免疫抗体库中获得的抗体其亲和力较从天然抗体库中获得的要高， 而且无交叉免疫源性。我们选用呼吸道合胞病毒感染患儿的淋巴细胞作为基因来源， 将减少抗体的多样性， 但可以从相对较小库容的抗体库中获得高亲和力特异性抗体。通过初步鉴定， 我们所构建的抗体基因库库容量为1.8×106， 经过3轮淘筛， 特异性Fab抗体得到较好的富集。因此， 我们成功构建了一免疫噬菌体抗体库， 为后续的实验和进一步研究打下了良好的基础， 也将有益于小儿呼吸道合胞病毒感染的诊断、 治疗和预防。
参考文献
［1］ Hoogenboom HR， de Bruine AP， Hufton SE， et al. Antibody phage display technology and its applications［J］. Immuno Technol， 1998， 4(1): 1-20.
［2］ 李晓琳， 侯宗柳， 刘建生， 等. 超大容量非免疫人源性Fab抗体库的构建［J］. 云南医药， 2006， 27(2): 94-97.
［3］ Ogra PL. Respiratory syncytial virus: the virus， the disease and the immune response［J］. Paeditr Respir Rev， 2004， 5(2): 119-126.
［4］ 何 维. 医学免疫学［M］. 北京: 人民卫生出版社， 2006: 24-48.
［5］ Hughes D. Therapeutic antibodies make a comeback［J］. Drug Discovery Today， 1998， 3(10): 439．
［6］ Clackson T， Lowman HB. Phage displayA practical approach［M］. Oxford University Press Uk， 2004: 15-28.
［7］ Binyamina L， Borghaei H， Weiner LM. Cancer therapy with engineered monoclonal antibodies［J］. Update Cancer Therapeutics， 2006， 1(2): 147-157.
［8］ Kang XP， Yang BA， Hu YY， et al. Human neutralizing Fab molecules against severe acute respiratory syndrome coronavirus generated by phage display［J］. Clin & Vac Immunol， 2006， 13(8): 953-957.
