时间：2023-08-17 18:04:59
关键词：植物；WRKY转录因子；抗病；生物信息学
中图分类号：S718.46；Q7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1191-05
植物在长期进化过程中形成了一系列机制，以适应和抵御各种生物和非生物逆境，在众多的适应性机制中，基因表达的转录调节在植物应答环境信号刺激反应过程中起着重要作用。转录因子是植物中最重要的一类调节基因。WRKY是近年来新发现的植物特有的新型锌指型转录调控因子， 是一类植物特有的转录因子家族，因在其N-端含有由WRKYGQK组成的高度保守的7个氨基酸序列而得名，WRKY基因首先被克隆于甘薯[1]，随后在约20多种植物中证实存在WRKY蛋白，并阐明了相应的分子生物学功能[2]，WRKY家族转录因子主要与植物的抗逆性和衰老等生理过程有关。病原菌、伤害和植物激素类物质等多种外界因素均能诱导WRKY基因的表达[3]。本研究以GenBank上登录的拟南芥（Arabidopsis thaliana）、欧芹（Petroselinum crispum）、辣椒（Capsicum annuum L.）、水稻（Oryza sativa L.）和毛白杨（Populus tomentosa）5个物种的22个WRKY家族抗病转录因子为材料，利用生物信息学方法研究该转录因子编码区的变异，为其他植物WRKY抗病基因克隆及其研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
数据资料来源于美国国立生物技术信息中心NCBI（http：//ncbi.nlm.nih.gov/）核苷酸数据库和国家水稻数据中心（http：///），其中拟南芥有13种，AtWRKY40 NM_106732、 AtWRKY60 NM_128058、 AtWRKY48 NM_124329、AtWRKY25 NM_128578，对丁香假单胞菌起负调控作用[4-6]；AtWRKY18NM_119329的中度水平表达会引起PR基因表达及对丁香假单胞菌的抗性增强[7]；AtWRKY41 NM_117177具有双重调控作用，能够抵抗细菌和真菌病原物的重要下游基因的产物，抗丁香假单胞菌[8]；AtWRKY70 NM_115498，参与两条抗性信号转导途径的调控交叉点，即通过激活SA介导的抗病信号转导途径，同时又抑制JA介导的抗病信号转导，调控拟南芥的抗病反应，主要对丁香假单胞菌起抗病作用[9]；AtWRKY33 NM_129404作为JA/ET介导途径中的正调控子，在抗真菌病原菌方面发挥作用，如防治灰霉病[10]；AtWRKY3 NM_126385对抗腐生病原菌起正调控作用；AtWRKY4 AF425835可以抗青枯病与腐生病原菌，超表达时对假单胞菌有毒小种的抗性增强， 对软腐病菌抗性减弱[11]；AtWRKY29 NM_118486是MAPK通路中可作为典型的WRKY基因参与拟南芥植株的抗病信号的转导[12]；AtWRKY6 NM_104910可以抗细菌、病毒、卵菌和真菌[13]；AtWRKY27 AF418310抗青枯病[14]。辣椒有3种，CaWRKY-a AY391747抗烟草花叶病毒[15]；CaWRKY2 DQ402421抗丁香假单胞菌[16]；CaWRKY1 AY229992通过负调控作用抗病菌[17]。欧芹3种，PcWRKY4 AF204925、PcWRKY5 AF204926均为抗大豆疫霉菌的激发子[18]；PcWRKY1 PCU48831抗大豆疫霉菌[19]。毛白杨有1种，PtWRKY23 EF051079抗叶锈病[20]。水稻2种，OsWRKY71 AB190817参与赤霉素信号传导，脱落酸介导的信号传导，依赖于R基因的防卫反应信号途径，抗白叶枯病；OsWRKY13 EF143611参与茉莉酸介导的信号传导、水杨酸介导的信号途径，抗白叶枯病和稻瘟病。
1.2 转录因子系统发育树的构建
利用Maga 5.0软件对NCBI数据库中搜索到的对病原菌有调控作用的转录因子和基因全长序列进行系统进化树的构建。采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，对生成的系统发育树进行Bootstrap校正，得到最终的系统发育树。
1.3 转录因子保守基序的分析
利用在线MEME 4.8.0软件（http：//meme.sdsc.edu）对转录因子的氨基酸序列进行保守基序分析。
1.4 转录因子编码蛋白质的三级结构分析
利用在线CPHmodels工具对9种蛋白质进行同源建模，并利用高级结构预测软件RasMol对各转录因子和基因编码的蛋白质三维结构进行分析。
2 结果与分析
2.1 不同植物抗病WRKY转录因子系统发育树的构建
对22个WRKY家族抗病转录因子进行系统发育树构建，结果（图1）表明，可以将这22个抗病WRKY转录因子分为2大类群，7个亚类群。第一大类群中的欧芹PcWRKY1，辣椒CaWRKY-a、CaWRKY2，拟南芥AtWRKY4、AtWRKY3、AtWRKY25、AtWRKY33都含有两个WRKY结构域。拟南芥WRKY抗病转录因子中对腐生病原菌起正调控作用的为AtWRKY3和AtWRKY4，二者抗腐生病原菌，起正调控作用[12]。
欧芹PcWRKY1对大豆疫霉菌有抗性作用[19]，拟南芥AtWRKY33对灰霉病起抗性作用[11]，而辣椒CaWRKY-a对烟草花叶病毒起抗性作用。从系统发生树（图1）上可以看出，这3个转录因子组成第一个亚类群，其中拟南芥AtWRKY33与辣椒CaWRKY-a亲缘性相近，而与欧芹PcWRKY1的亲缘性次之，但目前的研究表明其在抗病原理上并不相同，有待进一步研究。
拟南芥AtWRKY25和辣椒CaWRKY2聚为第二亚类群，二者均对丁香假单胞菌起调控作用；拟南芥AtWRKY3和AtWRKY4聚为第三亚类群，二者均对腐生病原菌起调控作用。
拟南芥AtWRKY48、毛白杨PtWRKY23和辣椒CaWRKY1聚为第四亚类群。研究表明，拟南芥AtWRKY48对丁香假单胞菌起负调控作用[5]，辣椒CaWRKY1对丁香假单胞菌、烟草花叶病毒等起负调控作用[17]，毛白杨PtWRKY23对叶锈病起抗性作用。
拟南芥AtWRKY6、AtWRKY18、AtWRKY60、AtWRKY40，水稻OsWRKY71和欧芹PcWRKY4聚为第五亚类群，其中对细菌、真菌、卵菌、病毒起抗性作用的拟南芥AtWRKY6[13]单独成一类，拟南芥AtWRKY18、AtWRKY60和AtWRKY40均对假单胞菌有抗性作用[4，7]，而拟南芥AtWRKY18和水稻OsWRKY71均会引起R基因表达抗病，且都是通过SA代谢途径起到抗病作用[4]，而欧芹PcWRKY4为抗大豆疫霉菌因子。
拟南芥AtWRKY27、AtWRKY29和水稻OsWRKY13聚为第六亚类群。在抗病方面，拟南芥AtWRKY27抗青枯病，AtWRKY29是MAPK通路中能够抵抗细菌和真菌病原物的重要下游基因的产物，水稻OsWRKY13参与茉莉酸介导的信号传导、 水杨酸介导的信号途径，抗白叶枯病和稻瘟病。
拟南芥AtWRKY41、AtWRKY70与欧芹PcWRKY5聚为第七亚类群。研究表明，它们均属于锌指结构C2-HC（C-X7-C-X23-H-X1-C）型[21]，其中拟南芥AtWRKY41与AtWRKY70均对细菌具有抗病性，但抗病途径并不相同[8，10]，而欧芹PcWRKY5对大豆疫霉菌因子有抗性，它们在抗病方面并不完全相同。
2.2 不同植物抗病WRKY转录因子保守基序的分析
由图2可知，22个抗病的WRKY转录因子都具有保守基序1和2，部分WRKY转录因子之间也有共性。系统发育树中第一大类群的1、2、3亚类群中的欧芹PcWRKY1，辣椒CaWRKY-a、CaWRKY2，拟南芥AtWRKY4、AtWRKY3、AtWRKY25和AtWRKY33都具有基序9和基序12，而第一大类群的其他亚类群和第二大类群的其他 WRKY转录因子都不具有基序9和基序12。
第五亚类群的拟南芥AtWRKY6、AtWRKY18、AtWRKY60和AtWRKY40，水稻OsWRKY71，欧芹PcWRKY4都具有基序5和基序6，而第一大类群的其他亚类群和第二大类群的其他WRKY转录因子都不具有基序5和基序6。第四亚类群中辣椒CaWRKY1和毛白杨PtWRKY23特有的基序为基序18。第七亚类群的拟南芥AtWRKY41和AtWRKY70，欧芹PcWRKY5都具有基序17。研究表明，拟南芥AtWRKY18和水稻OsWRKY71通过水杨酸代谢途径抗病[4]，基序分析表明，二者共有基序1、2、4、5、6和14。拟南芥WRKY转录因子中对腐生病原菌抗性起正调控作用的AtWRKY4和AtWRKY3都具有基序11和基序10。许多拟南芥WRKY转录因子作为防卫信号的负调控因子起作用， 如AtWRKY18、AtWRKY25、AtWRKY27、AtWRKY40、AtWRKY41、AtWRKY48和AtWRKY 60，这些WRKY转录因子都具有基序1、2、6和5。拟南芥AtWRKY70编码的蛋白质参与两条抗性信号转导途径，一是通过激活SA介导的抗病信号转导途径，二是抑制JA介导的抗病信号转导途径，从而调控拟南芥的抗病反应[10]，其仅有基序1、2、19和20。
2.3 不同植物抗病转录因子编码蛋白质的三级结构分析
高级结构决定蛋白质生物学功能，对蛋白质高级结构的预测和分析，有助于理解蛋白质结构与功能之间的相关性[22]。由图3可知，拟南芥AtWRKY4和AtWRKY25转录因子编码的蛋白质三级结构相似，均属于抗细菌型转录因子[6，12]。欧芹PcWRKY1和辣椒CaWRKY-a转录因子编码的蛋白质三级结构相似，辣椒CaWRKY-a对烟草花叶病毒具有抗性作用，而欧芹PcWRKY1对大豆疫霉菌有抗性作用。水稻OsWRKY13、欧芹PcWRKY4和PcWRKY5、拟南芥AtWRKY18和AtWRKY40编码的蛋白质三级结构相似。辣椒CaWRKY1和毛白杨PtWRKY23，拟南芥AtWRKY48和AtWRKY33编码的蛋白质三级结构相似，但其功能不尽相同[5，10]，有待进一步研究。研究表明，拟南芥AtWRKY18和AtWRKY6，欧芹PcWRKY1以及水稻OsWRKY13的C末端结构域可与（T）（T）TGAC（C/T）序列（W-box）相结合，产生特异性作用，参与植物防卫反应作用[23，24]。
3 小结
通过对22个抗病WRKY家族转录因子进行系统发生树、基序以及蛋白质三级结构分析，得出22个抗病WRKY转录因子分为2个大类群，7个亚类群。第一大类群由欧芹PcWRKY1、PcWRKY4，辣椒CaWRKY1、 CaWRKY-a、 CaWRKY2，拟南芥AtWRKY4、 AtWRKY3、 AtWRKY25、 AtWRKY33、AtWRKY48、AtWRKY6、AtWRKY18、AtWRKY60和AtWRKY40，毛白杨PtWRKY23，水稻OsWRKY71组成。拟南芥AtWRKY41、AtWRKY70、AtWRKY27和AtWRKY29，欧芹PcWRKY5，水稻OsWRKY13组成第二大类群。22个转录因子都具有基序1和2，系统发育树中第一大类群中的拟南芥AtWRKY4和AtWRKY25，欧芹PcWRKY1和辣椒CaWRKY-a具有相似的蛋白质三级结构，都具有基序9和基序12，拟南芥AtWRKY33和AtWRKY48具有相似的蛋白质三级结构，都具有基序18；系统发育树中第四亚类群中的辣椒CaWRKY1和毛白杨PtWRKY23具有相似的蛋白质三级结构。
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【摘要】 目的 预测人类新基因EOLA1的生物学功能。方法 基于EOLA1全长cDNA序列，应用生物信息方法，从序列比对、染色体定位、基因结构分析、编码蛋白理化性质分析、蛋白质位点和序列模式预测等几个方面对EOLA1进行分析。结果 EOLA1编码的蛋白EOLA1经网上同源性比对没有发现与之高度同源的人类已知蛋白;EOLA1与鼠111002L19蛋白高度同源，到目前为止，对鼠111002L19蛋白功能也不清楚;应用辐射杂交细胞系(RH)作图系统发现EOLA1定位于Xq27.4;对其二级结构进行预测发现在EOLA1蛋白分子中存在酪氨酸激酶Ⅱ和蛋白激酶C磷酸化位点以及1个螺旋转角螺旋(HTH)基序。结论 人新基因EOLA1编码蛋白质的一级和二级结构特征赋予EOLA1信号转导能力，有可能作为信号分子在LPS激活人血管内皮细胞的过程中发挥作用。
【关键词】 新基因;EOLA1;生物信息学
【Abstract】 Objective To explore the biological function of human novel gene EOLA1.Methods Many bioinformatics methods were used to analyses and predict the function of EOLA1 based on the fulllength cDNA of EOLA1.Results We didn’t find any human protein high homologous with EOLA1 by homology comparison on line.However，EOLA1 was high homologous with rat 111002L19 protein of which the function was unclear up to now.The genomic DNA of EOLA1 contained 5 exons，spanning about 6 294 bps，and was mapped to human chromosome Xq27.4.We found that EOLA1 secondary structure contained αhelix，βLamellosa and βturn，and a helixturnhelix(HTH)motif by bioinformatics analysis.We scanned PROSITE of EOLA1 on line，and found that EOLA1 contained:(1)Nglycosylation site(3639 NCTI);(2)Protein kinase C phosphorylation site(79 SFR，3335 SQR);(3)Casein kinase II phosphorylation site(100103 TPDE).Conclusion The information got by bioinformatics analysis indicates that EOLA1 may play an important role in process of Human vascular endothelial cell activation as a transcription factor.
【Key words】 novel gene;EOLA1;bioinformatics
随着人类基因组计划和越来越多的真核生物基因组完成，现代基因工程学已经步入了后基因组时代[1]。研究的热点从基因测序转移到基因功能表达与调控。近年来可用的基因序列与结构信息的指数级增长，生物信息学领域，或称之为计算生物学(computational biology)领域在基础生物医学领域起着越来越大的作用[2]。生物信息学是内涵非常丰富的学科，其核心是基因组信息学，包括基因组信息的获取、处理、存储、分配和解释。基因组信息学的关键是“读懂”基因组的核苷酸顺序，即全部基因在染色体上的确切位置以及各DNA片段的功能;同时在发现了新基因信息之后进行蛋白质空间结构模拟和预测，然后依据特定蛋白质的功能进行药物设计[34]。了解基因表达的调控机理也是生物信息学的重要内容，根据生物分子在基因调控中的作用，描述人类疾病的诊断、治疗内在规律。它的研究目标是揭示“基因组信息结构的复杂性及遗传语言的根本规律”，解释生命的遗传语言。生物信息学已成为整个生命科学发展的重要组成部分[56]。人类对基因的认识，将从以往的对单个基因的了解，上升到在整个基因组水平上考察基因的组织结构和信息结构，考察基因之间在位置、结构和功能上的相互关系[78]。
近来的研究表明，基因组不仅是基因的简单排列，它有其特有的组织结构和信息结构，这种结构是在长期的演化过程中产生的，也是基因发挥其功能所必须的。弄清楚生物体基因组特有的组织结构和信息结构是解译生命遗传语言的关键。Oti等[9]对疾病的潜在基因进行预测和优先排序，对不同的生物信息学策略进行了总结，并列举了一些有用的网络工具和生物信息学方法，为研究疾病相关基因提供了范例。EOLA1是本课题组于2002年应用抑制消减杂交技术发现的人类新基因[10]，本研究中我们基于EOLA1全长cDNA序列，应用目前比较成熟的生物信息学分析方法对EOLA1基因从以下几个方面对其进行比较详细的生物信息学分析:①序列比对;②EOLA1在人类染色体上的定位;③EOLA1结构分析;④编码蛋白理化性质分析;⑤编码蛋白的蛋白质位点和序列模式预测。
1 材料与方法
1.1 序列比对
ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，输入EOLA1的全长序列，应用BLAST工具进行比对分析。对于比对计算产生的分值，用统计学方法加以说明，以了解比对结果是否具有统计学意义。相关的参数E代表随机比对分值不低于实际比对分值的概率。对于严格的比对，E值必须低于一定阈值才能说明比对的结果具有足够的统计学意义，排除了由于偶然的因素产生高比对得分的可能[11]。
1.2 EOLA1在人染色体上的定位
通过基因与基因组重叠群的序列比对，可以快速有效地把基因定位在基因组中。以EOLA1全长序列检索GenBank数据库中的UniGene库，查找与其对应UniGene序列簇(ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/clust.cgi)，获得1个同源序列簇，再经网上辐射杂交细胞系(RH)作图系统(ncbi.nlm.nih.gov/genemap)确定EOLA1在染色体定位[12]。
1.3 EOLA1基因结构分析
登陆NCBI相应的网站分析EOLA1 cDNA序列中重复片段、编码区、启动子、内含子/外显子、转录调控因子结合位点等信息。
1.4 EOLA1编码蛋白的理化性质分析
蛋白序列分析软件包ANTHEPROT 4.3是法国的蛋白质生物与化学研究院开发出的蛋白质研究软件包。软件包包括了蛋白质研究领域所包括的大多数内容，功能非常强大。应用此软件包，使用个人电脑，便能进行各种蛋白序列分析与特性预测。我们应用该软件对EOLA1的理化性质进行了详尽的分析。
1.5 EOLA1编码蛋白的二级结构和序列模式预测
二级结构是指α螺旋和β折叠等规则的蛋白质局部结构元件。不同的氨基酸残基对于形成不同的二级结构元件具有不同的倾向性。按蛋白质中二级结构的成分可以把球形蛋白分为全α蛋白、全β蛋白、α+β蛋白和α/β蛋白等4个折叠类型。预测蛋白质二级结构的算法大多以已知三维结构和二级结构的蛋白质为依据，用人工神经网络、遗传算法等技术构建预测方法[1314]。还有将多种预测方法结合起来，获得“一致序列”。总的来说，二级结构预测仍是未能完全解决的问题，一般对于α螺旋预测精度较好，对β折叠差些，而对除α螺旋和β折叠等之外的无规则二级结构则效果很差。二级结构预测我们仍然用ANTHEPROT 4.3软件进行。对于蛋白位点和序列模式预测在expasy.ch/swissmod/SWISSMODEL.html网站上进行。
1.6 EOLA1编码蛋白的同源性比对分析和三维结构预测
蛋白质的三维结构是蛋白质在体内发挥功能的存在形式，能够提供丰富的功能信息。本研究应用SWISSMODEL Workspace蛋白质模建平台对EOLA1编码的蛋白质进行同源性比对分析和三维结构预测[1516]。该平台可以提供在线分析，网址是:http:swissmodel.expasy.org/.根据提示，输入EOLA1氨基酸序列即可反馈同源性蛋白信息和三维结构预测结果。
2 结果
2.1 人新基因EOLA1在GenBank中的序列比对结果
ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，输入EOLA1的全长序列，应用BLAST工具进行比对分析，共有67条序列和EOLA1具有同源性，其中分值大于或等于200且E值小于0.01的共有14条，多为人类新mRNA或假想蛋白的编码序列(图1)。EOLA1和鼠RIKEN基因有77%的同源性，关于该基因的相关信息可以参考文献[15]。
2.2 EOLA1在人染色体上的定位
以EOLA1 cDNA序列检索GenBank数据库中的UniGene库，查找与其对应UniGene序列簇，获得1个同源UniGene序列簇UniGene Cluster Hs.82171(ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/clust.cgi).UniGene来自于对GenBank中序列(尤其是EST)自动拼接而形成的序列簇，每一个序列簇可以代表1个唯一的基因，且经网上辐射杂交细胞系(RH)作图系统(ncbi.nlm.nih.gov/genemap)已将每个序列簇在染色体上位置作了确定，因此，UniGene将基因的染色体定位、组织表达谱和同源序列有机地整合在一起。通过比较EOLA1序列与UniGene序列簇的同源性可将其定位于染色体的相应位置，如图2所示将EOLA1定位于人染色体Xq27.4.表1 EOLA1基因的内含子大小及内含子/外显子边界以EOLA1 cDNA序列为起始，查找人X染色体，显示其从152370221～152376515跨越了6 294 bp，被内含子分割为5个外显子，见图3，其中外显子用黑框显示，内含子大小用kb显示。所有的外显子内含子边界序列遵循AG/GT规则(表1)。
图3 EOLA1基因的基因组DNA结构
Fig.3 The genome DNA structure of EOLA1
分析第一个外显子上游5′侧翼区2 kb序列，在-704 kb～-681 kb含预测的启动子，但无典型的TATAbox结构，在该区域附近可找到几个推导的转录因子结合位点，如SP1、GATA1、TFⅢA、GREB、Pit1、AP2B和NF1.至于该区域内是否含真正转录启动子尚须进一步的实验研究。
ncbi.nlm.nih.gov/ORF，在EOLA1基因全长cDNA中找到1个完整的ORF结构，其推导的编码蛋白EOLA1一级结构由158个氨基酸组成(图4)。经同源性检索，与任何已知人类蛋白质无高度同源性。
2.4 EOLA1编码蛋白的理化性质分析
在ANTHEPROT 4.3软件的编辑页面里输入EOLA1的氨基酸序列，另存为EOLA1.seq文件。打开EOLA1.seq文件进行相应的分析。表2显示的是EOLA1各种氨基酸的含量:亮氨酸含量最高(12.65%)，谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸次之(均为8.22%)，其余氨基酸含量均小于7%.EOLA1的分子量为17.89 kDa，等电点为6.43，亲水性强(-0.189)。表2 EOLA1各氨基酸残基含量
2.5 EOLA1编码蛋白的二级结构和序列模式预测
图5为ANTHEPROT 4.3软件对EOLA1蛋白二级结构的分析结果，EOLA1存在螺旋、折叠和转角等二级结构模式。H代表螺旋，图中表示为蓝色;E代表折叠，图中表示为橙色;T代表转角，图中表示为绿色;C代表其它松散结构，图中表示为黑色。
对于蛋白位点和序列模式预测在expasy.ch/swissmod/WISSMODEL.html网站上进行，发现EOLA1存在1个螺旋转角螺旋(HTH)基序;无信号肽及跨膜区域，提示EOLA1为胞内可溶性蛋白;经查找PROSITE位点，结果找到(1)N糖基化位点:位于氨基酸3639(NCTI);(2)PKC磷酸化位点:位于氨基酸79(SFR)和氨基酸3335(SQR);(3)酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点:位于氨基酸100103(TPDE);(4)2个N肉豆蔻酸化位点:位于氨基酸6267(GMTPAQ)和氨基酸8186(GVIAGL).EOLA1蛋白序列及其结构分析见图6.其中，HTH基序用下划波浪线表示:氨基酸5273;N糖基化位点以下划直线表示:氨基酸3639;磷酸化位点分别为:(1)PKC用方框表示:氨基酸79和3335;(2)酪氨酸激酶Ⅱ用下划虚线表示:氨基酸100103;(3)N肉豆蔻酸化用阴影表示:氨基酸6267和8186.
2.6 EOLA1编码蛋白的同源性比对和三维结构预测
应用SWISSMODEL Workspace平台对EOLA1编码的蛋白质进行同源性比对分析和三维结构预测。反馈结果提示EOLA1和Activating Signal Cointegrator 1(ASC1)有17.93%的氨基酸序列一致。SWISSMODEL Workspace平台以ASC1为模板预测出EOLA1的三维结构(图7)。E值为9.20e32，SWISSMODEL Workspace平台估计预测准确度为99.90%以上。图7a为模板蛋白ASC1的三维结构，图7b为预测的EOLA1三维结构图。
3 讨论
疾病相关新基因的功能研究是一项复杂而有重要意义的系统工程。当前人类已步入后基因组研究时代，人类基因组的全部序列已经获得，意味着人类基因组的研究将全面进入信息提取和数据分析阶段，即生物信息学发挥重要作用的阶段。同时功能基因组和蛋白质组的大量数据已开始涌现。如何分析这些数据，从中获得生物结构、功能的相关信息是基因组研究取得成果的决定性步骤。生物信息学是在此背景下发展起来的综合运用生物学、数学、物理学、信息科学以及计算机科学等诸多学科的理论方法的崭新交叉学科。目前已经开发出了非常多的模块和算法[17]，应用于了解新基因基本信息之后进行蛋白质空间结构模拟和预测，然后依据特定蛋白质的功能进行药物设计。了解基因表达的调控机理也是生物信息学的重要内容，根据生物分子在基因调控中的作用，描述人类疾病的诊断、治疗内在规律。它的研究目标是揭示“基因组信息结构的复杂性及遗传语言的根本规律”，解释生命的遗传语言。
对一个新发现的人类疾病相关新基因，我们首先需要应用生物信息学技术对其进行初步分析，预测其生物学功能，为后期的研究指引方向。EOLA1系本课题组于2002年新发现的人类基因，系LPS刺激ECV304细胞后表达上调的基因，在此，我们应用生物信息学技术对EOLA1进行了比较全面的分析。其编码的蛋白EOLA1经网上同源性比对没有发现与之高度同源的人类已知蛋白。EOLA1与鼠111002L19蛋白高度同源，但到目前为止，对鼠111002L19蛋白功能也不清楚。对其二级结构进行预测，发现在EOLA1蛋白分子中存在酪氨酸激酶Ⅱ和蛋白激酶C磷酸化位点以及1个HTH基序。三维结构预测和蛋白质同源性分析发现EOLA1和ASC1有17.93%的氨基酸序列一致性。ASC1系HanJong Kim于1999年确认的一种新的核受体转录辅激动子(transcription coactivator of nuclear receptors)[18]。2006年Lakshminarayan将其归类为ASCH超家族，并认为该家族存在1个和PUA功能域相关的折叠结构，是一个新的功能域，可能参与RNA的代谢。经比对发现EOLA1和ASC1三维结构非常类似，因此可以推测EOLA1可能系ASCH超家族的一员，参与核受体信号的传递。应用生物信息学发现EOLA1具有的这些生物学特征赋予EOLA1具有转导信号的能力，可以作为信号分子发挥作用。在抑制消减杂交实验中，EOLA1属于LPS刺激后表达上调基因。结合该信息我们推测EOLA1可能作为信号分子参与了LPS激活内皮细胞的过程。但对其功能的推测尚须实验证实。
将生物信息学与实验研究有机结合起来，可以显著加快实验进程，并对实验结果有所预期。由于生物信息学分析可以依靠互联网快速进行，且花费低廉，用以指导实验，可以做到有的放矢，避免巨大的浪费;反过来生物信息学分析的结果需要实验验证，并通过实验修正错误。
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关键词：转录因子；NAC；生物信息学分析；抗逆性
中图分类号：R318.04 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4199-06
Bioinformatics of the Transcription Factor NAC with Stress Resistance
KANG Mei-ling， ZHOU Zhen-hua， TIAN Zhong-jing， MING Dong-feng， MA Li
（College of Life Science， Zaozhuang University， Zaozhuang 277160，Shandong，China）
Abstract：Physicochemical property， hydrophobic/hydrophilic，membrane structure，secondary structure，functional domains of resistance-realated members in the family of plant transcription factor NAC were analyzed with bioinformatics. The results showed that primary structure of 17 NAC members had obvious hydrophobic and hydrophilic areas， -helix and β-sheet were discovered in their primary structure prediction. Their secondary structure was composed of -helix， β-sheet and irregular curl. Three-dimensional structure of the NAC proteins was established by homology modeling. Phylogenetic analysis showed that they were divided into four groups. By the alignment of multiple sequence，conservative sections of these members were obtained and a pair of primer was designed. The work will pave the way for further studing the expression regulation of the NAC transcription factors related with resistance.
Key words：transcription factor；NAC；bioinformatics analysis；resistance
生物体内有大量的转录因子存在，它实际上是一种反式作用因子，存在于众多不同的信号转导途径中，可以特异地与顺式作用元件结合，从而调控目标基因的表达，是各种生化生理活动调节的关键所在[1]。根据DAN结构域的不同可以把转录因子分为很多家族，其中NAC家族就是一种具有多种生物功能的植物特异转录因子。1996年，Souer等[2]在矮牵牛中获得了第一个NAC基因。之后，研究者在拟南芥中发现了CUC2[3]。CUC2和NAM同属于NAM亚族，水稻的ONAC300、金鱼草的CUP和南瓜的CmNACP也属于这个亚族[4]。Vroemen等[5]从拟南芥中分离到与CUC1和CUC2同源的CUC3。CUC促进茎尖分生组织的分化，参与器官边界的形成。随后，AtNAM的发现及其相关功能的研究表明，分生组织的形成和器官边界的建立与AtNAM密不可分[6]。2003年，Ooka等[7]首次将NAC家族分为2个大组和18个亚组。之后对NAC亚家族成员的研究基本上都是以Ooka的分类为依据展开的。作为具有重要功能的转录因子，利用生物信息学的方法对其进行全面分析，有助于获取关于NAC家族更多的信息，从而为其功能基因组学的研究提供更为详尽的数据。
1 转录因子NAC的结构特点与生物学功能
NAC转录因子有着鲜明的特点，在其蛋白质的N端有高度保守的约150个氨基酸组成的NAC结构域。NAC结构域不包含任何已知的蛋白质结构域，而是由几个不规则的卷曲螺旋围绕着一个扭曲的β-折叠片构成，与典型的螺旋-转角-螺旋结构有较大差别[8]。典型的NAC蛋白质的N端有一段高度保守区，该区可进一步分成A～E五个亚结构域，可结合蛋白质或DNA，也可参与二聚化过程。碳端是高变区，对转录过程起调控作用[9]。
NAC转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，广泛分布于苔鲜植物到高等双子叶植物中。研究表明，NAC转录因子具有诸多生物功能，详见表1。
2 数据与方法
从NCBI网站的GenBank数据库中筛选了17种NAC家族中与抗逆性有关的核苷酸序列及其对应的氨基酸序列，以此作为试验分析数据（表2）。
分析方法：NAC编码蛋白质的理化性质采用Protparam预测；疏水性/亲水性采用ProtScale进行预测；跨膜结构域采用TMPred预测；卷曲螺旋采用COILS预测；蛋白质二级结构采用GOR4预测；蛋白质亚细胞定位采用WOLF PSORT预测；蛋白质三维结构分析与同源建模采用CPHmodels和RasMol-Raindy进行；进化树的构建采用软件ClustalW2和MEGA 4.1进行分析，各分析软件的网址见表3。
3 结果与分析
3.1 蛋白质的一级结构分析
3.1.1 氨基酸序列的理化性质分析 利用在线分析软件Protparam对17种NAC家族成员逐一进行分析，得出对应氨基酸序列的理化性质分析结果。结果（表4）表明，这些成员的氨基酸残基数为293～464，分子量为33 164.7～51 493.5，差异比较小，PI值多在6～8范围内。经分析发现，含量最丰富的氨基酸有Ser、Gly、Pro、Ala等。这些氨基酸使蛋白质序列有较多的负电荷。通常不稳定系数小于40，则认为该蛋白质是稳定的，反之则不稳定。供试的17种NAC成员有8种是不稳定的，推测这8种成员在植物体内可能是阶段性出现，如在受到胁迫诱导时才会表达的一些蛋白质，会表现出一定的不稳定性，而长期存在于植物体内的NAC成员则相对稳定。另外，这17种成员的平均疏水性皆为负值，都在-0.6左右，说明这些蛋白质是亲水性蛋白质。
3.1.2 疏水性/亲水性的预测和分析 蛋白质亲疏水性氨基酸的组成是蛋白质折叠的主要驱动力，通过亲水性预测可以反映蛋白质的折叠情况。蛋白质疏水区域可以作为评判潜在跨膜区的参考依据。采用ProtScale对17种NAC家族成员蛋白质序列进行分析（图1），发现这17种成员在40～50区、110～130区有较强的疏水性，表明这些区段很可能以-螺旋的形式存在，在60～80区域有着强烈的亲水性，表明该区段是由一些非-螺旋的二级结构组成。
3.1.3 跨膜结构的预测和分析 跨膜结构是蛋白质和膜内在蛋白质通过静电作用和氢键键合作用与膜结合而形成的一段氨基酸片段，一般由20个左右的疏水性氨基酸残基组成，主要形成-螺旋。用在线工具TMPred对这17种NAC成员进行分析，结果（图2）表明，没有强烈的推荐模型，推测NAC是通过核孔复合体进入细胞核的，并不像膜结合蛋白质那样，通过一些跨膜结构域固定在细胞膜上或细胞器膜上。
3.1.4 卷曲螺旋预测 利用在线分析工具COILS对17种NAC成员进行分析，结果（图3）表明，这些成员都没有太多的卷曲螺旋，只在150～200氨基酸残基位置出现少量的卷曲螺旋，在这些转录因子的N段、C段都有极少量的卷曲存在。卷曲螺旋是一种无规则结构，在蛋白质中起固定作用，即稳定已形成的转录因子复合物。150～200区段虽然不在保守区范围内，但在长久的进化过程中，这种结构却相当保守，这段无规则卷曲的存在对于NAC发挥其作用是必需的。
3.1.5 亚细胞定位预测 利用在线工具WOLF PSORT分别对17种NAC成员蛋白质的亚细胞定位进行分析，结果表明，它们都定位于细胞核，这也从侧面表明了这些转录因子的存在及其发挥功能的场所是细胞核。
3.2 蛋白质二级结构的预测和分析
二级结构指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕的方式。二级结构主要有-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲。采用GOR4分析17种NAC家族成员的二级结构，结果表明，这17种NAC家族成员在二级结构上也具有很高的相似性。如图4所示，列出的这3种成员的二级结构预测结果显示在0～50、150～250氨基酸残基的位置上，一般出现-螺旋，100～150氨基酸残基的位置上则出现较多的β-折叠，其他位置则被无规则卷曲填充。总体来看，17种成员的二级结构有着较高的相似性，这从某种程度上反映了它们在三级结构上的相似性。
3.3 蛋白质三维结构分析与同源建模
蛋白质三级结构的预测和分析，对理解蛋白质结构和功能之间的关系有一定的作用。生物信息学的快速发展，使通过生物软件构建蛋白质的结构得以实现。利用CPHmodels对17种NAC家族成员进行同源建模，并用RasMol-Raindy将结果进行处理（图5）。结果表明，17种成员在三级结构上表现出了非常高的相似性，基本上都是几个螺旋元件包围着一个扭曲的β-折叠片，推测它们是以这种结构结合DNA，进而发挥作用。另外，在这些结构群之外都有一段较长的无规则卷曲，推测这个小尾巴的功能是在转录因子NAC结合顺式作用元件时的稳定结合体。
3.4 NAC蛋白质家族系统进化树的构建
根据蛋白质的序列或结构差异关系可构建分子进化树或种系发生树。采用MEGA 4.1中的Neighbor-Joining算法，自检举1 000次，构建了17种成员的进化树（图6），这17种成员主要分为4个类群，最早在0.4水平形成两个分支，一支是类群Ⅳ，另一支在0.3水平形成明显的3个新的分支，它们是类群Ⅰ、类群Ⅱ、类群Ⅲ。总的来说，这些NAC家族成员在0.4水平才出现分支，说明它们的亲缘关系相近。
3.5 相似性比对分析及保守区的获得
利用在线程序ClustalW2进行序列比对，找到了NAC家族中的保守区段。如图7所示，能明显看出N端的5段保守区。这5段保守区对应的二级结构可以根据对应的氨基酸残基顺序，从二级结构预测中找到对应的结构。在此基础上可以设计出这类抗逆性相关的NAC成员的保守区引物（图8）。利用该引物可进一步克隆到NAC基因的保守区，再通过RACE技术就能进一步获得NAC全长基因，为未鉴定过的植物获得NAC基因奠定了基础。
4 小结
近年来的研究表明，多达几十种植物中的NAC转录因子被发现，并对其空间结构和生物学功能的研究进行了探讨，但是由于种类的多样性和生物功能的复杂性，还未能明确阐明不同的NAC转录因子其空间结构与调控机制之间的关系，因此通过多种生物信息学方法，对与抗逆性相关的NAC转录因子成员进行多角度的分析，为其高效利用提供参考，也为植物在抗逆性方面的遗传改良奠定理论基础。
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通过多重序列比对筛选保守序列是生物信息学方法的基础，几乎所有的注释序列的意义、研究序列结构的方法都是建立在此基础上的。保守序列是指病毒在进化过程中基因组序列保持不变或变异很小的序列。在进化过程中，变化很小或者不变的序列往往承担着极其重要的功能，一旦出现变化，功能就会受影响或者被破坏，物种就有被淘汰的危险。因此，保持不变或变化很小的序列可能具有相同的功能。国际上已有专门的数据库（如Blocks、PROSITE和IDENTIFY）和分析软件（如BLAST、DNAsis、FASTA、GCG、MOST、Emotif和Tool）用于保守序列的分析。
本研究利用生物信息学方法对欧文氏杆菌基因组进行分析，发现了71个与铁代谢相关的基因，分别参与了欧文氏杆菌中铁载体的生物合成以及铁的运输、吸收、贮存和调控。
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关键词：蓖麻（Riciuns communis L.）；油体固醇蛋白质；生物信息学
中图分类号：S565.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）11-2930-04
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.11.056
蓖麻（Riciuns communis L.）是大戟科（Euphorbiaceae）蓖麻属（Ricicuns）一年或多年生双子叶植物，广泛生长在热带、亚热带和温带地区，是世界十大重要油料作物之一[1]。植物种子中有一种储存营养物质的细胞器――油体[2-4]，其内部主要成分为三酰甘油，外部则为磷脂单分子层及嵌入其内的油体结合蛋白质组成的半单位膜[5]。油体结合蛋白质主要有三种――油脂蛋白质、油体钙蛋白质和油体固醇蛋白质。油脂蛋白质由N-和C-末端两个亲水区域及中间疏水锚定区域组成。N-和C-末端暴露在油体表面，能够提供空间位阻和负电斥力来维持油体的稳定[5]。Chen等[6]在油体中发现了3种微量蛋白质分别称为Sop1、Sop2、Sop3。Sop1称为油体钙蛋白质。油体钙蛋白质由N-端亲水钙结合区域、C-端亲水性磷酸化区域和中间疏水锚定区域组成，可能在油体成熟、脂肪动员和提高油体稳定性方面发挥作用[5]。Sop2、Sop3被称为油体固醇蛋白质-A和油体固醇蛋白质-B[7]。油体固醇蛋白质是一种羟基固醇脱氢酶，属于SDR家族[8，9]。N-端的疏水区域由两个亲性α螺旋夹着一个疏水锚定结构组成，在此疏水区域中部有Pro knob结构[10]，其余部位分为NADPH、固醇结合区域和两者之间的活性位点S-（12X）-Y-（3X）-K[10]。Sop3和Sop2蛋白质的固醇结合区域不同[7]。近来发现油体蛋白质也存在于根尖和芽等胚后组织中，推测在植物体内还存在未被发现的信号转导通路[8]。本试验以拟南芥蛋白质作“种子”在蓖麻的蛋白质数据库中搜索，结合关键字搜索方法对蓖麻油体固醇蛋白质进行生物信息学分析，以期为该蛋白质的鉴定提供参考。
1 材料与方法
1.1 蓖麻基因组数据库搜索
以“Steroid dehydrogenase”为关键字在蓖麻基因组数据库（http：///search.php）中搜索，下载基因、cDNA和蛋白质序列；以6条拟南芥油体固醇蛋白质[11]作为“种子”，分别在蓖麻数据库（http：///search.php）中进行Blastp搜索，E设为1×10-30，获得同源的油体固醇蛋白质的基因、cDNA和蛋白质序列，去除重复后，再利用NCBI保守结构域分析工具（http：//ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi？）对所获得的蛋白质家族进行鉴定，检测是否有SDR（短链脱氢/还原酶超家族）的保守结构域。
1.2 蓖麻油体固醇蛋白质生物信息学分析
蓖麻油体固醇蛋白质的理化性质采用Protparam软件进行预测；内含子、外显子组成采用Spidey软件进行分析；疏水性/亲水性采用ProtScal软件进行分析；蛋白质二级结构分析采用GOR4软件进行分析；蛋白跨膜结构域采用TMHMM 2.0 Server软件；信号肽结构采用SignalP4.1 Server软件进行预测；蛋白质三维结构分析与同源建模采用CPHmodels软件和RasMol-Raindy软件；进化树的构建采用软件ClustalW2软件和MEGA 4.1软件，所有软件使用的都是其默认值，部分分析软件的网址见表1。
2 结果与分析
2.1 蛋白质的一级结构分析
2.1.1 氨基酸序列的理化性质分析 通过综合分析，最终获得11条完整的蓖麻油体固醇蛋白质基因，见表2。利用在线分析软件Protparam对10种油体固醇蛋白质进行分析，得到其对应的氨基酸序列的理化性质，结果见表2。大部分蛋白质成员外显子数为3或6，氨基酸残基数为317～352，分子量为35.286 0～39.918 9 kDa，等电点PI为5.35～9.57。不稳定系数表明，有8种成员在植物内可能阶段性出现。亲水性大部分都为正值，大部分成员都为亲水蛋白质。信号肽预测表明，这11个蛋白质不存在信号肽。由于Slo11蛋白质基因不完整，所以后续分析中只选择其他10个蓖麻油体固醇蛋白质。
2.1.2 疏水性/亲水性的预测和分析 采用ProtScale软件对10个蓖麻油体固醇蛋白质进行分析，结果（图1）表明，以Slo1、Slo9为例，1～40区域有强烈的疏水性，可能为跨膜区域与油体内部疏水的三酰甘油相接合处，其他区域无明显规律。
2.1.3 跨膜结构的预测和分析 利用在线软件TMHMM 2.0 Server对10个蓖麻油体固醇蛋白质进行跨膜结构预测，图2结果表明，除了Slo5蛋白质在氨基酸25、200位点各有一个跨膜区，其他9个蛋白质（如Slo9）均只在25位点处有一个跨膜结构。
[关键词]高中生物；信息化；技术；整合
高中生物教师应该采取科学、合理的措施将信息技术应用在教学课堂，有助于高中生物教学模式的创新，可以调动学生的学习积极性，从而更好地开展高中生物教学，全面提升学生的学习能力。
一、利用信息技术创设教学情境，激发学生学习兴趣
传统的灌输式教学模式并不注重学生的主观能动性，加之高中生物知识具有抽象性的特点，久而久之，很多学生失去了学习生物的兴趣。而利用信息技术创设情境，通过图文、音频等内容刺激学生的感官，从而达到激发学生学习兴趣的目的。
教师可以利用信息技术创设问题情境，调动学生的好奇心和探索欲望。例如，在学习蛋白质一课时，教师在课堂的开始可以先给学生播放一段有关氨基酸脱水缩合的动画视频，并配上音效。通过画面、音效激发学生对蛋白质知识的探索欲望。教师提问学生：蛋白质的组成有什么特点。之后学生就能够自主观察视频，并分析蛋白质中氨基酸、肽键等组成部分的个数。另外，教师也可以通过展示图片，刺激学生的视觉，以激发学生的学习兴趣。例如，给学生展示有关大头婴儿的图片，然后提问学生：“大头婴儿的头比较大，面部肌肉松驰，表情比较呆滞，对外界事物的刺激反应较低。为什么婴儿长期吃劣质奶粉会出现这种症状？”设置这个问题的主要目的在于引导学生对劣质奶粉的关注，从而引出蛋白质的重要性。之后教师可以再继续提问学生：“食物中含有的蛋白质能否被人体吸收？”以引导学生关注蛋白质的组成。这时再配以氨基酸的图片和视频，使学生能够更直观地了解到氨基酸的结构特点。另外，由于氨基酸和蛋白质都属于微分子，肉眼很难观察到。所以高中生物教师在该节课堂的讲授中应该重视利用信息技术创新知识的呈现形式。总之，高中生物教师应该重视利用信息技术创设教学情境，以激发学生的学习兴趣。这也就意味着高中生物教师应该掌握基本的信息技术，并结合教材实际内容，创设新颖、灵活的教学模式，以推动我国新课程标准的改革。
二、利用信息技术开展形式多样的学习活动，突出学生主体地位
在传统的教学课堂中，教师为教学的主体，学生处于被动接受知识的状态。这种教学模式不仅效率低，且无法突出学生的主体地位。我国新课改明确指出，高中生物教师应该以学生为主体，培养学生的综合实践能力。这就意味着高中生物教师必须转变教学理念，改变单一的灌输式教学方式。
自主学习的优点在于教师是课堂的组织者和引导者，而学生处于主动学习的状态。高中生物教师应该充分发挥信息技术的优势，开展形式多样、丰富多彩的自主学习活动，突出学生的主体地位，促进学生全面发展。例如，在讲授一节有关其他植物激素的知识时，教师可以在课堂的开始展示有关香蕉催熟苹果的图片，使学生对激素产生好奇心。接着让学生通过网络搜集各种植物激素的主要合成部位和主要作用。在这个自主学习活动开始前，教师先引导学生阅读教材内容，在了解大概内容的基础上进行探索活动。最后，让学生在搜索完成后，转换成图表。这样通过整个自主学习活动，学生既能学到植物激素的知识，也能提高自身的自主学习能力。
另外，教师也可以利用信息技术开展小组合作学习活动。例如，在上述课堂的开始阶段，通过PPT课件提供给学生有关水稻恶苗病图片和科学家发现水稻感染赤霉菌后出现恶苗病的素材，引导学生思考，说出水稻恶苗病的原因。再引导学生做出假设，使学生能够积极投入到探究活动中，从而突出学生的主体地位。然后教师让学生开展分组实验探究活动：探究赤霉素是否是植物激素。在此过程中，为了降低学生的学习难度，教师可以通过展示有关赤霉素探究的资料，以帮助学生开展分组探究实验。这样的教学活动既能提高学生的综合学习能力，还能够突出学生主体地位，使学生成为课堂的主人。由此可见，高中生物教师应该利用信息技术，创设新颖、灵活的教学活动，改变学生被动学习的现状。
三、利用信息技术丰富教学资源，拓展学生知识面
在传统的高中生物课堂中，学生学到的知识多数是来自于教师传授或是从教材上获取。但是教师本身的知识储备有限，且教材内容知识过于生硬、专业，导致学生出现生物知识匮乏的问题。因而在互联网技术快速发展的背景下，教师应该重视通过网络获得大量的教学资源。
例如，教师可以通过搜集与教材内容相关的生物知识，创设知识网站，使学生能够通过网站拓展知识面。主题网站应该以高中生物知识为基础内容，将所有生物学科知识集中在一起。另外，还应该保证教师和学生都能够访问网站。学生可以下载学习资源，教师可以进行教学资源的整合、上传、下载。网站还可以创建交流区，促进学生之间的知识交流，增加学生的生物知识储备。
除此之外，教师在教学课堂的开始利用信息技术下载各种有关教学的学习资源，并将其整合在一起上传至网络共享平台，实现学生的课前预习。打破传统教学课堂时间、地域的限制，实现学生能够实时的汲取生物知识。例如，教师可以利用在讲授光合作用的知识时，在课前进行课件、教案、案例的教学资源下载，再进行加工处理，把网络教学资源与教材内容充分结合，创建符合学生认知水平的教学知识体系。在课堂上将光合作用通过视频生动、形象地动态展示给学生。这样做能使学生了解到更深层次的光合作用知识，从而达到拓展学生知识面的目的。由此可见，在互联网技术快速发展的背景下，高中生物技术应该充分利用信息技术扩大自身的知识储备，并引导学生对生物知识、生物技术等内容的关注。
四、利用信息技术实现生物知识的形象化，提高W生学习效率
在传统教学模式中，教师传授生物知识主要以口头讲述的方式为主。这样方式会使高中生物课堂学习气氛变得枯燥、无味。加之高中生物知识的抽象性，导致学生出现了学习效率低的问题。因此，高中生物教师应该重视利用信息技术，改变生物知识的传授方式和展示方式，从而降低学生的学习难度，提高学生的学习效率。
例如，高中生物中光合作用、细胞分裂等知识内容，由于用肉眼很难观察到，如果教师只是纯粹的进行口述，以高中生的形象力很难理解教师所讲解的内容。可见，利用信息技术增强生物知识的形象化、具体化是十分重要的。尤其是高中阶段的学生理解能力和创新思维能力有限，如若不改变知识的呈现方式，势必会降低的学习效率，甚至会使学生产生厌烦生物的情绪。因此，高中生物教师应该实现信息化技术与教学课堂的有效融合，创新教学模式，降低高中生物学习难度，从而提高学生的学习效率。
综上所述，信息技术与高中生物教学的整合是现代化教学体系改革的必然。因而高中生物教师应该转变教学理念，创新教学模式，创建生物知识学习网站，并降低学生的学习难度，从而提高学生的综合实践能力。这一特点正契合新课改的教学理念，可见高中生物教师应该深入研究信息化技术与高中生物课堂的最佳融合方式，提高高中生物课堂的教学效率。
参考文献：
[1]单鹏华.信息技术与高中生物课程整合的教学研究[D].桂林：广西师范大学，2014.
[2]季忠云.高中生物教学中现代信息技术与传统教学有效整合的研究[D].苏州：苏州大学，2014.
关键词：初中生物；信息技术；应用现状
一、农村初中生物教学中信息技术的应用现状
（一）基础设施建设水平偏低
受到多种主观或客观因素的影响，我国农村经济发展水平普遍要落后于城市，这也就导致了农村许多初中的信息技术硬件水平建设较差，还没有形成系统的信息化教学规模。各地政府虽然每年都会对农村初中建设投入大量资金，但由于农村人口众多，存在大量的农村学校，政府提供的建设资金难以满足所有学校建设和发展的需求，这也就为农村初中生物教学中应用信息技术产生了一定的消极影响。
（二）信息化教学观念落后
目前，部分经济水平发展较好的农村中学已经建立了完善的信息化教学体系，并且在初中生物教学中，通过多种方式开展信息化教学模式，对提升初中生物教学质量发挥出了重要的作用。然而，农村初中生物教学中传统教学观念根深蒂固，许多教师依然坚持使用传统的教学模式，即使应用多媒体技术，也只是将黑板上所写的内容转移到了课件当中，本质上与传统教学模式并没有差别。同时，许多教师的信息化素养偏低，课件中所提供的视频、图片、音频等素材，许多内容都存在着与教学内容贴合度较低的问题，难以发挥出信息技术的重要意义。
（三）过于依赖信息技术
随着信息技术的不断发展，教育信息化所起到的作用越来越高，许多农村中学生物教师都清楚的意识到了这一点，在日常教学工作中充分的使用了多媒体技术。而由于中学生物教师的信息技术素养普遍偏低，许多教师无法正确的使用信息技术，经常出现过度依赖信息技术的问题，尤其是对于一些不必要使用信息技术的简单知识点，这不仅降低了初中生物课堂教学的效率，还对学生的实践和创新能力产生了消极影响。
二、农村初中生物教学中应用信息技术的意义
生物学主要研究的内容，是自然界中多种生物的生命现象和规律，而想要了解到这些现象和规律，应用信息技术开展生物教学就具有了重要的意义。多媒体课件中，学生能够更深入的了解多种生物的组织结构，有效的激发了学生学习生物的积极性，对于提升学生的生物学习水平具有重要的意义。
（一）有助于学生更直观的了解生物知识
在生物信息化教学的背景下，具有高度抽象性的生物知识，以更具象的形式体现了出来，这也就使得学生能够更直观的了解到教师讲解的生物知识，不仅能够有效的提升学生的学习水平，还能够培养学生的自学能力和思维能力。
（二）有助于激发学生的学习兴趣
由于生物知识具有复杂性和抽象性的特点，在传统的教学模式下，学生面对生物知识很容易产生学习困难的问题，甚至会产生一定的厌学心理。而将初中生物教学与信息技术相结合，抽象、复杂的生物知识能够以更具体的方式体现出来，并且能够让学生领略到生物世界的魅力，对于激发学生的学习积极性起到了重要的推动作用。
三、農村初中生物教学中信息技术的应用策略
（一）分清教学的主次关系
教育信息化是我国教育体系发展的重要方向，但实际上，信息化手段只能够作为辅助教学形式而存在，传统的教学模式依然是课堂的主体，具有无可替代的作用。因此，初中生物教师需要吸收教育信息化的先进理念，也要在课堂教学中广泛的应用信息技术，但同时也不能够过度使用信息技术，要明确信息技术是传统教学模式的辅助工具。因此，教师仍然需要对教育信息化进行深入的学习，通过摸清信息技术的定位和作用，更好的使其与传统教学模式相结合，对学生学习水平的提升起到重要的推动作用。
（二）合理应用信息技术
在教育信息化的背景下，如何使用信息技术是对教师教学能力提出的新的挑战。教师需要根据自身的教学能力和教学经验，在各个教学阶段合理的使用信息技术。例如，在课堂开始前，教师可以通过视频、音频等方式，引入课堂教学的主题，为学生构建良好的学习氛围。在一些教学的重点、难点中，可以充分的利用信息技术，将重点知识利用更直观的方式体现出来，能够有效的提升学生对知识点的记忆和理解水平。在课后训练时，教师可以调动互联网中海量的教学资源，按照课堂教学的核心内容，将初中生物教学与教学资源相结合，从而有效的提升初中生物教学中信息技术的利用率和利用水平。
（三）制作优秀的课件
课件的制作水平不仅体现出了教师的信息化教学水平，还对学生的学习水平产生了直接的影响。在课件制作中，教师要根据教学进度、学生整体学习水平、学生的掌握度等多方面因素进行考虑，保证课件与实际教学工作有相关联性，而不能在网上随意下载其他人的成本课件。即使所下载的课件制作精良，也需要针对课堂教学的实际情况进行相应的调整，从而符合学生的学习水平。例如，在讲解血液循环问题时，教师可以自己制作或下载血液循环的动画，一边播放动画，一边对每一个部分的血液循环状况进行讲解，这种方式能够有效的使抽象的问题具象化，提升了学生的学习水平。而对于一些学生存在疑惑的问题，教师可以将动画播放的速度放缓，并着重进行讲解，从而使学生能够更深入的了解血液循环系统。
（四）与生物实验相结合
生物学是一种注重实验的科学，在生物实验中，学生可以更深入的了解到不同的物种、细胞的生命特征和活动规律，对提升生物学习水平、激发学习积极性具有重要的意义。而受到课时等因素的影响，往往无法提供大量的时间给学生进行生物实验，因此，可以通过信息技术，将实验的过程更直观的反馈给学生，并对于实验中的重点和难点进行详细的讲解，从而让学生提升实验学习水平。例如，在受精卵教学中，教师可以通过视频等方式，讲解精子与卵细胞是如何进行结合并展开细胞分裂，又是如何形成胚胎的。同时，在子宫着床等环节，通常会消耗大量的时间，使用教学视频进行快放，可以让学生更清晰的见到其演变规律，不仅提升了初中生物教学的趣味性，还提升了学生对于初中生物知识的理解程度，对提升学生的学习水平具有重要的意义。
结语
教育信息化是初中生物教学发展的重要方向，而受到多种主观或客观因素的影响，我国农村的基础设施建设水平较低，并且信息化教学观念落后，即使认同信息技术在初中生物教学中意义的教师，也经常存在过度依赖信息技术的问题，导致初中生物教学中应用信息技术的水平偏低，没有发挥出信息技术的重要意义。因此，在教学中，教师要分清传统教学与信息化教学的主次关系，合理的利用信息技术，并制作更优秀、符合实际的课件。同时，在生物实验教学中，应该广泛的使用信息技术，对于提升农村初中生物教学水平具有重要的意义。
参考文献
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[3]顾红星.农村初中生物实验教学与信息技术的高效整合[J].中国教育技术装备，2013，（31）：1-2.
作者简介
【摘要】
目的用生物信息学软件分析贯叶金丝桃查尔酮合成酶基因编码蛋白的多种蛋白质性质，获取该基因的相关因素。方法利用protparam，gor4，protscale，protfun和netphos软件预测和分析贯叶金丝桃查尔酮合成酶基因编码蛋白的氨基酸组成、理论等电点、结构域、活性位点、卷曲螺旋、疏水性、糖基化位点、磷酸化位点及二级结构。结果推测贯叶金丝桃查尔酮合成酶基因编码蛋白分子式为：c1910h3056n508o565s18，理论等电点pi 6.12；并含有一个查尔酮合成酶活性位点：156 ? 172（ rlmmyqqgcfaggtvlr）。该蛋白含有163个α-螺旋，81个延伸链，145个无规则卷曲，1个n-糖基化位点，1个o-糖基化位点，17个磷酸化位点，包括8个丝氨酸磷酸化位点，8个苏氨酸磷酸化位点和1个酪氨酸磷酸化位点。结论该蛋白推测是一个疏水性稳定蛋白，属于连接酶。
【关键词】 贯叶金丝桃； 查尔酮合成酶基因； 生物信息学
abstract：objectiveto obtain information of chalcone synthase gene in hypericum perforatum, the character of this gene and its product protein were analyzed by a series of bioinformatics software.methodsthe character of chalcone synthase protein such as the constitution of amino acid, equipotential, domain, active site, coiled coil, hydrophobicity, glycogylation site, phosphorylation sites，second structure were analyzed by the protparam、gor4、protscale、protfun and netphos software.resultstheoretical pi of this protein was 6.12, and the formula was c1910h3056n508o565s18. this protein contained a chalcone and stilbene synthases active site from 156 to 172(rlmmyqqgcfaggtvlr). the results also showed that chalcone synthase protein had 163 α-helix, 81 extended strand, 145 random coil , 1 n-glycogylation sites, 1 o-glycogylation sites, 17 phosphorylation sites，8 serine phosphorylation sites, 8 threonine phosphorylation sites, 1 tyrosine phosphorylation sites.conclusionit was a hydrophobic and stable protein，belonged to ligase enzyme.
key words：hypericum perforatum; chalcone synthase gene; bioinformatics
查尔酮合成酶(chalcone synthase, chs)是植物次生代谢途径中黄酮类物质合成的关键酶,仅分布于高等植物中［1］，查尔酮合成酶是所有黄酮类化合物合成的关键酶，它介导了此类化合物合成的第一步，催化3分子的丙二酞辅酶a与1分子对羟基苯丙烯酞辅酶a缩合成柚皮素查尔酮，然后再由查尔酮异构酶异构化成不同的黄酮类化合物［2］。黄酮类化合物系色原烷和色原酮的衍生物，是一类在高等植物中大量存在的重要的次生代谢产物，具有很多重要的功能，如参与花色的形成、uv防护、抵抗病原体等等。目前研究表明，它们还与人类的健康有着密切的关系，具有消除氧自由基、抗炎、抗癌、保护心脑血管系统等多种药理作用［3，4］。
贯叶金丝桃主要含有黄酮类、挥发油等多种成分［5］，本文利用生物信息学的方法研究贯叶金丝桃chs基因的一级、二级结构，从而对该基因的理化性质、结构特征和功能等进行预测和分析，以期为该基因的深入研究提供参考和理论依据。
1 材料与方法
数据资料来源于 national center for biotechnology information（ncbi）核酸及蛋白质数据库中已注册的贯叶金丝桃（hypericum perforatum, af461105）的核酸序列及其对应的氨基酸序列。利用生物信息学数据库和互联网上的软件进行分析，用protparam［6］分析atpase e基因编码蛋白的氨基酸序列组成、分子量、等电点等理化性质；在ncbi对其保守结构域分析；用gor4［7］预测其二级结构；用protfun［8，9］和netphos［10］分析蛋白质功能。
2 结果
2.1 贯叶金丝桃查尔酮合成酶基因氨基酸序列的分析
该cdna全长1510bp，包括1170bp的开放读码框（open reading frame, orf），134个碱基的5'非翻译区（5'-untranslated region or 5'-utr），206个碱基的3'非翻译区（3'-untranslated region or 3'-utr），编码一个389个氨基酸的多肽。在scanprosite对其结构域分析贯叶金丝桃查尔酮合成酶基因含有一个查尔酮合成酶活性位点：156 - 172（ rlmmyqqgcfaggtvlr）。见图1。
2.2 贯叶金丝桃查尔酮合成酶基因编码蛋白的理化性质
用protparam对查尔酮合成酶(chalcone synthase, chs)基因编码蛋白的理化性质预测，推测该蛋白的分子式为c1910h3056n508o565s18，分子量是42 753.4da，理论等电点pi 6.12；该基因含leu (l)最多，占10.0%；不含pyl (o)、sec (u)、asx (b)、glx (z)、xaa (x)。总的带正电残基(arg + lys)为45，负电残基(asp + glu)为49。总的亲水性平均系数（grand average of hydropathicity (gravy)）为-0.117，预测该蛋白属于疏水性蛋白。该基因预测不稳定指数是35.38，属于稳定蛋白。
2.3 贯叶金丝桃查尔酮合成酶基因编码蛋白疏水性/ 亲水性的预测
利用protscale软件的kyte and doolittle算法对的查尔酮合成酶蛋白进行亲水/疏水性分析。正值越大表示越疏水，负值越大表示越亲水，介于+ 0.5到-0.5之间的主要为两性氨基酸，结果提示大约在贯叶金丝桃的查尔酮合成酶蛋白中339-346区域的疏水性最强，其次18-24，98-102，126-132，166-170，186-194，217-226，368-375,379-385区域具有较强的疏水性；348-360区域的亲水性最强，其次7-14，31-72，115-123，176-183，314-326区域具有较强的亲水性(见图2)。可见，贯叶金丝桃的查尔酮合成酶蛋白的疏水区域大于亲水区域。
2.4 贯叶金丝桃查尔酮合成酶基因编码蛋白的二级结构预测应用
gor法分析查尔酮合成酶(chalcone synthase, chs)基因编码蛋白的二级结构，结果在该氨基酸序列中，共有α-螺旋（alpha helix）163处，占总二级结构的41.90%；延伸链（extended strand）81处，占总二级结构的20.82%；无规则卷曲（random coil）145处，占总二级结构的37.28%。见图3。
2.5 贯叶金丝桃查尔酮合成酶基因编码蛋白质的结构分析和功能分类
protfun和netphos预测查尔酮合成酶(chalcone synthase, chs)基因编码的蛋白含有1个n-糖基化位点（336）；1个o-糖基化位点（3）；17磷酸化位点（63，133，153，250，282，318，332，353，3，24，44，132，197，204，245，360，40），包括8个丝氨酸磷酸化位点（63，133，153，250，282，318，332，353）, 8个苏氨酸磷酸化位点（3，24，44，132，197，204，245，360）和1个酪氨酸磷酸化位点（40），见图4。
protfun预测thhkt1蛋白的功能分类如图5箭头所示，推测该蛋白的功能可能是参与重要的中间代谢，这进一步预测该基因编码蛋白属于连接酶（ligase enzyme）。
3 结论
本文利用protparam对贯叶金丝桃查尔酮合成酶基因编码蛋白的理化性质预测，推测该蛋白的分子式为c1910h3056n508o565s18，分子量是42753.4da，理论等电点pi 6.12。属于稳定蛋白，并含有一个查尔酮合成酶活性位点：156 - 172（ rlmmyqqgcfaggtvlr）；利用protscale软件的kyte and doolittle算法对查尔酮合成酶蛋白进行亲水/疏水性分析表明贯叶金丝桃的查尔酮合成酶蛋白的疏水区域大于亲水区域。
应用gor法分析贯叶金丝桃查尔酮合成酶基因编码蛋白的二级结构表明，α-螺旋是该基因整体结构中的主要组成结构元件，延伸链和无规则卷曲散布于整个蛋白质中。protfun和netphos预测查尔酮合成酶(chalcone synthase, chs)基因编码的蛋白含有1个n-糖基化位点；1个o-糖基化位点；17磷酸化位点，推测该蛋白属于连接酶。
应用生物信息学方法对贯叶金丝桃查尔酮合成酶基因编码蛋白进行比对、分析，从而对其结构和功能进行推断和预测，为开展实验研究前提供尽可能多的信息，能为选择合适的实验方法提供理论参考，为进一步对该基因的功能研究提供线索。
【参考文献】
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【摘要】 目的: 研究湖南大围子猪SLADR基因特性， 评价该猪种在异种器官移植中是否具有应用前景。方法: 应用RTPCR扩增大围子猪SLADRA和SLADRB基因， 插入pUCMT载体， 双向测序， 用NCBI中的BLAST和ExPASY软件进行生物信息学分析。结果: 大围子猪SLADRA和SLADRB基因扩增片段大小分别为1 177 bp和909 bp， 均包含完整的开放阅读框， 分别编码252和266个氨基酸残基。生物信息学分析结果表明， 大围子猪SLADRA和SLADRB与人类相应的DRA、 DRB相比， 氨基酸同源性分别为82%和73%。SLA DR α链与人CD4 分子结合部位介于第124 至136 位氨基酸， 大围子猪SLADRA在该结合区域与人类相应的DRA存在两个氨基酸差异， 即: 第127位(lleVal)， 第136位(SerThr); SLA DR β链与人CD4 分子结合部位位于第134至148位氨基酸， 大围子猪SLADRB在该结合区域与人类相应的DRB相比氨基酸序列完全相同。与国际GenBank 已登录的许多猪种相比， SLADRA基因同源性高达100%， 而SLADRB基因在各猪种之间具有很高的多态性。结论: 克隆湖南大围子猪SLADRA和SLADRB基因， 该基因与人类相应的HLADRA和HLADRB基因高度同源， 提示该猪种有望作为异种移植的候选供体。
【关键词】 SLADR基因; 湖南大围子猪; 基因克隆; 异种移植
[Abstract] AIM: To evaluate the potential of Daweizi pigs as xenotransplantation dnors from pigs to humans by analyzing the characteristics of SLADR genes in Hunan Daweizi pigs. METHODS: SLADRA and SLADRB genes were amplified by RTPCR， cloned into pUCmT vectors， sequenced and analyzed through BLAST in NCBI and related software in ExPASY. RESULTS: The SLADRA and SLADRB genes were 1 177 bp and 909 bp nucleotides in length， which contain opening reading frame (ORF) and encode 252 and 266 amino acids respectively. Comparing the SLADRA and SLADRB genes with their counterpart sequences of human， the homologies of amino acid sequences were 82% and 73% respectively. The amino acids in SLA DR α chain of Daweizi pigs from position 124 to 136， which bind to human CD4， showed only two differences with HLA DRA: a lleVal change at position 127 and a SerThr change at position 136. The amino acids in SLA DR β chain of Daweizi pigs from position 134 to 148， which bind to human CD4， were identical with HLADRB. Further comparison with SLA sequences published in GenBank indicated that SLADRB gene found in Daweizi pigs has polymorphism while the homology of SLADRA gene is up to 100%. CONCLUSION: The cloned SLADRA and SLADRB in Hunan Daweizi pigs has high polymorphism with HLADRA and HLADRB in Human， indicates that Daweizi pigs have some advantages as xenotransplantation dnors from pigs to humans.
[Keywords]Swine leukocyte antigen DR allele (SLADR); Daweizi pigs; gene cloning; xenotransplantation
同种异体器官移植已成为治疗终末期器官衰竭的一种有效手段， 猪被认为是异种移植最理想的供体来源[1]。然而， 如何解决免疫排斥问题仍是阻碍临床大规模应用的主要问题之一[2]。猪的主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex， MHC)， 又称作猪白细胞抗原(swine leukocte antigen， SLA)， 是由紧密连锁的高度多态基因座所组成的染色体的一个遗传区域， 它作为主要组织抗原， 参与移植排斥反应， 是引起异种移植急性细胞性排斥的主要遗传因素[3]。通过对供体猪种进行筛查， 尽可能选择与人类MHC同源性较高的猪种将有助于提高异种移植物在人体内的存活时间， 为临床大规模开展将猪器官或细胞异种移植到人提供理想的供体猪种来源。
中国具有丰富的猪种种质资源， 不同的地域分布形成了猪种的多样性和遗传的相对稳定性， 为异种移植提供了可贵的研究和利用资源[4]。湖南大围子猪是我国特有的地方猪种之一， 亦是湖南省著名地方优良猪种， 具有繁殖力强、 抗逆性强、 耐粗饲、 肉质好、 生长慢、 饲料效率高等种质性状。但是， 大围子猪能否作为异种移植的供体， 尤其是该猪种细胞表面SLA特性如何， 目前尚不清楚。本研究将克隆湖南大围子猪SLADR基因， 分析其SLADRA和SLADRB基因特性， 比较与人CD4 分子结合部位大围子猪SLADR编码氨基酸与人类相应DRA、 DRB的同源性， 为评价湖南大围子猪在异种移植中的应用前景， 提供免疫学方面的依据。
1 材料和方法
1.1 材料 总RNA抽提试剂盒购自美国Gentra公司; cDNA第一链合成试剂盒购自Fermentas 公司; pUCMT载体、 引物、 电泳试剂等购自上海生工生物工程技术服务有限公司; PCR高保真克隆酶EasyA购自Stratagene公司; DNA marker(100 bp ladder)购自晶美生物工程公司; 湖南大围子猪来自湖南望城大围子猪保种基地。
1.2 方法
1.2.1 湖南大围子猪SLADRA和SLADRB基因引物设计 根据GenBank数据库中已登录的明尼苏达小型猪(Minnesota miniature swine)的SLADR序列(登录号为M93028， AB205163)， 采用PCRDESN软件设计以下引物。SLADRA: 上游引物 : 5′GGC ATC TAA GGA GAA AAT GAC3′; 下游引物: 5′CCA CTC AAA GTT TAT TGT ATT CAG3′， 预计扩增片段大小为1 177 bp; SLADRB: 上游引物: 5′TTG TCC TCT CCT GTT CTC CAG3′; 下游引物: 5′TAG GAC GCA GAG CAT AGC AGG3′， 预计扩增片段大小为909 bp。
1.2.2 RTPCR扩增湖南大围子猪SLADRA和SLADRB基因 在湖南大围子猪保种群中随机挑选两头个体， 以700 mL/L乙醇消毒耳尖取耳样组织， 按RNA抽提试剂盒(Gentra公司)说明书方法提取总RNA。测定每一样品总RNA的浓度， 模板定量为1 μg RNA， 按RevertAidTM First strand cDNA Synthesis kit说明书方法逆转录合成cDNA第一链。以合成的cDNA为模板进行PCR扩增， 20 μL PCR反应体系中， 分别加入下列物质: DEPC处理水13.5 μL， PCR缓冲液2 μL， 25 mmol/L MgCl2 1.6 μL， 10 mmol/L dNTP混合物0.5 μL， 50 mmol/L上、 下游引物各0.2 μL， 模板1.6 μL， EasyA 高保真酶0.4 μL。在PE9700 型PCR 扩增仪上完成PCR扩增， 扩增条件如下: 先95℃预变性2 min 30 s， 94℃变性40 s， 58℃～59℃退火40 s， 72℃延伸40 s， 完成35个循环， 最后72℃延伸5 min， 置 4℃保温。取3.5 μL PCR扩增产物， 1.5 g/L琼脂糖凝胶电泳， 以鉴定PCR扩增结果。
1.2.3 湖南大围子猪SLADRA和SLADRB基因克隆与鉴定 连接反应在10 μL体系中进行: 双蒸水3 μL、 PCR产物1 μL、 pUCmT载体1 μL混匀后加入5 μL SolutionⅠ， 16℃水浴连接过夜， 转化感受态大肠杆菌JM109(采用CaCl2法制备)， 4℃静置30 min后放入42℃水浴中热休克90 s， 加入300 μL预热的LB培养基， 37℃下振荡培养(200 r/min) 45 min， 将菌液平铺于含氨苄青霉素的固体培养基上， 37℃恒温箱中培养过夜。挑取单克隆， 在含氨苄青霉素200 mg/L的液体LB培养基中培养， 以菌液为模板， PCR鉴定为阳性克隆， 抽提质粒， 送上海英骏生物技术有限公司双向测序。
1.2.4 湖南大围子猪SLADRA和SLADRB基因生物信息学分析 用NCBI Homepage中的ORF对湖南大围子猪SLADRA和SLADRB基因的开放阅读框进行识别; 用ExPASY服务器中的PROSITE SCAN软件对SLADRA和SLADRB基因的功能域进行预测; 用NCBI中的BLAST及ExPASY服务器中的CLUSTALW等软件对获得的SLADRA和SLADRB基因的序列结构进行比较分析。
2 结果
2.1 湖南大围子猪SLADRA和SLADRB基因RTPCR扩增结果 RTPCR扩增结果显示， 两头湖南大围子猪SLADRA和SLADRB均有特异性扩增条带， 大小分别为1 177 bp和909 bp， 与预期扩增片段大小一致(图1)。
2.2 湖南大围子猪SLADRA基因测序结果 测序大围子猪SLADRA基因， 结果表明: 来源于两个不同个体的SLADRA基因序列是一致的， 其cDNA全长均为1 177 bp， 包含一个759 bp的完整的开放阅读框， 推测编码252个氨基酸。生物信息分析发现， SLADRA第1～23 位氨基酸为信号肽， 第24～107位氨基酸为α1 功能区， 第108～202位氨基酸为α2 功能区， 第203～252位氨基酸为穿膜和胞浆功能区。推测SLADRA蛋白中有1个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点， 6个N肉蔻酰化位点， 2个N糖基化位点， 2个蛋白激酶C磷酸化位点， 1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。
2.3 湖南大围子猪SLADRB测序结果 测序大围子猪SLADRB基因， 结果表明: 来源于两个不同个体的SLADRB基因序列是一致的， 其cDNA 全长为909 bp， 包含一个完整的开放阅读框， 大小为801 bp， 推测编码266个氨基酸。生物信息分析发现， SLADRB蛋白序列第1～29 位氨基酸为信号肽， 第30～123 位氨基酸为α1 功能区， 第124～217 位氨基酸为α2 功能区， 第218～266位氨基酸为穿膜和胞质功能区。推测SLADRB蛋白包括3个N肉蔻酰化位点， 1个N糖基化位点， 3个蛋白激酶C磷酸化位点， 1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。
2.4 湖南大围子猪SLADR与人类相应HLADR同源性比较 大围子猪SLADRA与人类的HLA DRA(BC071659)相比较， 在核苷酸水平同源性为88%， 编码的氨基酸序列同源性为82%。SLA DR α链与人CD4 分子结合部位介于第124至136位氨基酸， 大围子猪SLADRA在此结合区域与人类相应的DRA存在两个氨基酸差异， 即: 第127 位(Vallle)， 第136位(ThrSer)(图2)。
大围子猪SLADRB与人类的HLADRB*09012(AY622551)相比较， 在核苷酸水平同源性为82%， 编码的氨基酸序列同源性为73%。SLA DR β 链与人CD4 分子结合部位位于第134至148位氨基酸， 大围子猪SLADRB在此结合区域与人类相应的DRB相比氨基酸序列源性为100%(图3)。
2.5 湖南大围子猪SLADR基因与GenBank里其它猪种序列同源性比较 大围子猪与NIH小型猪d单倍型(M93028)、 湖南沙子岭猪(EF143987) SLADRA编码的氨基酸同源性为100%， 与GenBank里已发表的其它猪种的相应基因比较， 同源性高达99%以上。大围子猪SLADRB基因与GenBank登录的许多猪种核苷酸和氨基酸序列同源性分别是93%～95%， 89%～95%， 并根据氨基酸比较结果建立种系进化树(图4)。
3 讨论
免疫排斥反应仍是目前异种移植面临的最大难题， 其中供受体组织相容性是研究异种移植排斥反应的关键问题。因此， 组织相容性复合物即白细胞抗原是筛选供体时必须考虑的因素。异种猪抗原(主要是猪白细胞抗原SLA)是引起异种移植T淋巴细胞介导的急性细胞性排斥反应的主要遗传因素[2]。SLA被人T淋巴细胞识别存在直接识别和间接识别途径[3]。在直接识别途径中， 猪SLAⅡ类抗原经自身抗原提呈细胞(APC)处理， 提呈给人CD4+T辅助细胞参与免疫排斥反应。人T细胞对猪异种抗原的间接识别是指猪的异种抗原以外源性蛋白质抗原的方式为人APC摄取、 加工后， 引起人特异性CD4+ T细胞的激活与效应。在异种移植细胞性排斥反应中， 异种抗原被人T细胞识别到底哪种识别途径占优势目前尚不清楚。Andres等[5]认为在异种胰岛移植中， 种系差异越小直接识别途径占优势， 种系差异越大、 间接识别途径占优势。因此， 对SLAⅡ类基因的深入研究将有助于猪人异种器官移植的供受体配型选择， 有助于攻克异种移植排斥反应， 筛选异种移植供体。
目前， 国内外都积极致力于研究各猪种的SLA， 筛选异种移植供体， 更好的为异种移植应用于临床服务。国外对Yucatan小型猪[6]、 Westran猪[7]等， 国内对中国西双版纳微型猪[8]、 湖南沙子岭猪[9]、 广西猪、 贵州香猪、 云南小耳猪[10， 11]等猪种作为研究模型， 通过克隆、 测序分析SLA基因， 研究SLA在异种移植排斥反应的发生机制中的作用。吴群等[12]对中国海南五指山猪进行研究， 指出五指山猪种在与人类MHC遗传基因水平相似性方面有一定优势; 在与人CD4相结合部位， 五指山猪SLADRB参与结合的关键氨基酸残基与人类完全相同， 并且通过基因工程对五指山猪SLADRA分子两个不同的氨基酸残基进行必要的修饰和改造， 使其成为理想的异种移植供体。
湖南大围子猪是湖南省著名的地方优良猪种， 具有繁殖力强、 抗逆性强、 耐粗饲、 肉质好、 生长慢、 饲料效率高等种质性状。本研究首次克隆湖南大围子猪的SLADRA和SLADRB序列。SLA位于猪的第七号染色体， 由I类、 Ⅱ类和Ⅲ类3个基因簇组成。SLAI类基因和SLAⅢ类基位于7号染色体的短臂， SLAⅡ类基因则位于染色体长臂上。研究表明: SLAⅡ类抗原的基因主要有β链基因和α链基因两种， 分别编码SLAI类抗原的β肽链和α肽链。编码SLAⅡ类抗原β链的基因座SLADR和SLADQ已被证明存在显著的等位基因多态性， 而这种多态性与SLAⅡ类抗原的生物学特性又是密切相关。生物信息分析发现， SLADRA基因为高度保守序列， 各猪种间DRA基因同源性高达99%以上， 而SLADRB基因在各猪种间具有丰富的多态性， 这一结论与文献报道一致。
大围子猪SLADRA 和SLADRB 与人类相应的DRA、 DRB相比， 氨基酸同源性分别为82%和73%。人CD4分子在排斥反应中发挥重要作用， SLA DR α链与人CD4 分子结合部位介于第124～136 位氨基酸， 大围子猪SLADRA在该结合区域与人类相应的DRA存在两个氨基酸差异， 即: 第127 位(lleVal)， 第136 位(SerThr); SLA DR β链与人CD4 分子结合部位位于第134至148位氨基酸， 大围子猪SLADRB在该结合区域与人类相应的DRB相比氨基酸序列同源性为100%。该结果说明， 湖南大围子猪SLADR基因与人的相应基因组织相容性较好， 可在异种移植排斥反应中以直接识别途径即人CD4+T细胞直接识别猪细胞表面的SLAⅡ分子。
总之， 通过本研究首次成功克隆了湖南大围子猪SLADRA 和SLADRB基因序列， 发现该猪种与人类相应的DRA和DRB有高度同源性， 在免疫学特性方面具有一定的优势， 提示该猪种可作为异种移植侯选供体。
参考文献
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【摘要】
目的 应用生物信息学分析软件预测细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白（Eg. ferritin）氨基酸序列的结构与功能。方法 利用DNAman、NCBI/BLAST公共数据库对目的基因的同源性进行比较分析。应用DNAstar、Biosun 等生物分析软件对铁蛋白的二级结构、抗原表位进行预测分析，应用SWISSMODEL对蛋白的三维结构进行模拟。结果 检索Eg. ferritin氨基酸序列在其功能区的130AA内同源性为97.7%。不同生物间的同源性平均达40.79%。生物软件预测：Eg. ferritin的分子量约16.7 kD，含非极性氨基酸68个，预测其抗原表位肽段为7N-12E，36H -43V， 55S-62H， 69Q-76R， 82A-89E， 102I-107E， 117A -124S，129L-136T。结论 Eg. ferritin的结构和功能及其抗原表位的预测对选取有价值的抗原肽段提供了依据。
【关键词】 细粒棘球蚴中国大陆株；铁蛋白；生物信息学；预测分析
Abstract: Objective To predict the structure and function of Eg.ferritin using bioinformatics method. Methods Homology of ferritin gene was analyzed Using DNAman and NCBI/BLAST database and second structure and antigen peptide of Eg.ferritin and imitate 3D structure of Eg.ferritin was predicted using DNAstar， Biosun et.al. biological softwares to. Results Deduced ferritin amino acid sequence homology was 97.7% in the 130AA and average homology of different species was 40.79% with the published ferritin gene. And it had 68 nonpolar amino acids and had 9 antigen peptide such as 7N-12E， 36H -43V， 55S-62H， 69Q-76R， 82A-89E， 102I-107E， 117A-124S， 129L-136T. Conclusions Using softwares to predict Eg.ferritin structure and antigen peptide can provide some theoretical bases for selecting some valuable antigen peptides.
Key words： echinococcus granulosus；ferritin；bioinformatics；predicting analysis
铁蛋白（ferritin) 是普遍存在于生物体内的一种保守性较高的多功能多亚基蛋白，它不仅调节体内铁的含量，而且在抵抗氧化损害、调节细胞增殖及机体的免疫反应等方面发挥了重要作用［1-4］。据此推断铁蛋白在寄生虫的生理代谢活动中担负着十分重要的作用，因此，它也成为各种寄生虫疫苗研究中备受关注的候选分子。本文通过生物信息学方法预测细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白（Eg. ferritin）氨基酸序列的结构与功能，为进一步研究其生物学功能提供线索，为其在肝包虫的诊断、药物研发和疫苗筛选方面提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
Eg. ferritin基因由本实验室通过RT-PCR成功扩增，其它寄生虫ferritin氨基酸序列源自GenBank。
1.2 方法
通过DNAman、DNAstar对重组基因序列进行分析并推算出其编码的氨基酸序列。通过NCBI、BLAST在线软件将Eg. ferritin cDNA序列与同源性较高的其它动物ferritin基因序列进行同源性分析。通过蛋白质分析软件Biosun和DNAStar将肽链的二级结构（secondary structure）、亲水性参数（hydrophilicity）、抗原性参数（antigenicity）、可塑性参数（flexibility）、表面可能性（Surface Probability）等5种参数综合进行抗原表位的预测。
2 结果
2.1 Eg. ferritin基因开放阅读框基因序列
DNAman 软件对测序后的铁蛋白基因序列进行分析，测序结果表明该基因开放阅读框为435bp，基因序列，见图1。
2.2 Eg. ferritin氨基酸序列的同源性分析
NCBI/Genbank/BLAST进行氨基酸序列的比较分析结果表明，推导的铁蛋白氨基酸序列是由145个氨基酸残基组成，与已知Genbank中ferritin氨基酸序列比较，并且在其功能区内的130AA同源性达97.7%。有三处氨基酸残基 (阴影加黑标记) 与发表序列存在差异，见图2。
用DNAman 对不同生物的铁蛋白氨基酸序列进行同源性分析，其中与牛带绦虫(Taenia saginata)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、人铁蛋白H链、曼氏血吸虫(Schistosoma mansion)和肝片虫(Fasciola hepatica)的ferritin平均同源性达40.79%。图3（见封2）中黑色标记区域同源性达100%，粉色为75%，绿色为50%，黄色为33%。
2.3 Eg. ferritin二级结构的预测和蛋白三维结构的模拟
Biosun软件对蛋白二级结构的预测发现二级结构中α螺旋水平较高，而且该Eg. ferritin在真核及原核生物中未发现信号序列酶切位点，也未发现穿膜结构域（图4）。DANstar 对Eg. ferritin的氨基酸序列进行预测，见表1。表1 Eg.ferritin所含氨基酸种类（略）
DNAstar和Biosun软件对Eg. ferritin亲水性参数、可塑性参数以及抗原表位肽段进行预测，两种软件的预测结果基本符合，见表2、3。表2 Eg. ferritin中20种氨基酸可塑性参数（略）表3 Eg.ferriti抗原肽段的预测（略）
3 讨论
随着基因组和功能基因组研究的深入，生物信息学理论和方法也得到了迅猛发展和广泛应用。利用生物信息学方法对蛋白的二级及三级结构进行分析和模拟是一种快捷有效的方法［5-6］。本实验室于2006年成功克隆出细粒棘球蚴中国大陆株Eg. ferritin［7］并注册到GenBank。经DNAman软件对本室扩增的Eg. ferritin基因序列进行分析，发现该序列与互联网上检索序列(肯尼亚株)有所不同：检索的基因序列为522bp，而我们得到的基因序列长度为562bp，并推导出其包含145AA。在NCBI/BLAST公共数据库中氨基酸序列在130AA内同源性达97.7%。Thompson研究认为细粒棘球绦虫在长期的演化过程中会引起遗传基因的改变［8］，据此我们考虑该基因可能是我国细粒棘球蚴虫株特有的，有望作为预防当地包虫病疫苗的候选基因，可能在虫株的鉴别诊断上也有一定的应用价值。
利用DNAman等生物学软件推导铁蛋白的氨基酸序列，预测其蛋白质二级结构和抗原表位，以及模拟其三级结构。经软件分析的结果来看，铁蛋白是生物体中的一个保守性很高的蛋白，并在长期进化过程中被保留下来，其具有的相同氨基酸序列，可能是影响整个铁蛋白功能的核心区即功能域；DNAstar，Biosun对其二级结构进行了预测，结构显示在Eg.ferritin中α螺旋水平较高，说明该蛋白的柔韧性和弹性较好，具有较好的稳定性，在真核及原核生物中未发现信号序列的酶切位点和跨膜结构域，并且两软件对铁蛋白抗原肽段的预测结果基本一致，提高了预测的可靠性。这些区域和结构的确认为铁蛋白功能的进一步探索提供了一定的参考资料，并且为后续选取Eg. ferritin中有抗原价值的肽段，制备多肽段联合疫苗提供了一种可借鉴的手段。
参考文献
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关键词： 生物信息学 案例教学法 实践教学
1.生物信息学学科特点
生物信息学是当今生命科学的重大前沿领域之一，是一门交叉学科，包含生命过程中各种信息的获取、加工、存储、分配、分析、解释等在内的所有方面，综合运用数学、计算机科学和生物学等方法与技术，阐明和理解大量数据包含的生物学意义[1]。随着20世纪80年代人类基因组计划的实施，生物信息学蓬勃发展，并渗透到生物学研究的各个领域。掌握生物信息学相关技术及分析能力已成为生物专业本科毕业生的必要要求[2]。因此，做好生物信息学教学工作对提高生物信息学研究水平具有重要的理论和实践意义[3]。然而由于学科的综合性和学科本身的迅猛发展，生物信息学课程教学仍然处于探索阶段，目前还没有成熟的生物信息学教学模式，各高校尚处于摸索探讨阶段。
2.案例教学法概述
案例教学法（Case-Based Learning），指在教师的指导下，根据教学目的，通过呈现案例材料，组织学生以团体和小组讨论、角色扮演等方式对案例进行调查、阅读、思考、分析、讨论和交流等活动；经过分析讨论，将课本中的理论与案例材料结合起来，并利用理论分析说明复杂的案例内容。案例教学法引导学生学习新的知识，加深对理论的认识，训练学生运用所学知识分析和解决实际生物学问题[4]。
不同于传统教学模式注重“知识的传授”，案例教学法更注重“能力培养”。案例教学法不直接给学生提供解决案例问题的标准答案或者具体方法，而通过教师引导学生积极讨论得出问题的解决方法，侧重于理论应用，是一种“以学习者为中心的学习方法”。
案例教学可划分为讲解定义型、综合分析型和操作技能型三种类型。（1）讲解定义型，引入案例，对基本概念和原理进行讲解；（2）综合分析型，提出问题，学生通过讨论给出解决案例问题的方案或者对已有方案进行评价；（3）操作技能型，引入案例，使学生掌握相关理论课程的基本应用技能。案例教学还可以综合其他教学方法，如以问题为基础的教学法共同改善课堂教学效果[5]。
案例教学法基本环节包括：教师根据学科特点提出案例；引导学生辩论交流、提出解决方案；完成与解决案例；教师评价与总结[4]，[6]，[7]。案例教学过程中，首先教师把握整体教学进度，选用与本专业课程有关的案例，案例选择要具体、易于学习和理解，能够引起学生的兴趣，调动学生学习主动性；其次，将案例分解，从子案例中提出问题，启发学生思考，鼓励学生对案例进行分析、讨论甚至辩论，提出解决方法，逐步完成案例；最后，引导学生完成和解决案例，分析点评整个案例教学过程及结果[4]。
3.案例教学法应用于生物信息学本科教学的意义
生物信息学课堂讲授以介绍生物信息学的相关算法、原理、方法为主，这也是教学的重点和难点。传统“知识传授”型讲课方式容易让学生觉得枯燥乏味、晦涩难懂，产生畏惧心理[8]。运用案例教学法，能够帮助学生更深入理解算法的思想，真正掌握解决问题的思路，培养科学的思维能力。
另外，生物信息学是一门实用性较强的学科，大学本科阶段开设生物信息学课程主要目的不是开发新的数据库和发展新的生物数据分析方法，而是如何利用现有数据库资源查找特定数据，并根据科研实践需要分析整合数据资源，为后续科研奠定基础，具有极强的实践意义。要达到实践目的，除了让学生掌握生物信息学的基本理论和方法、数据库和软件的原理外，更重要的是让学生亲身实践，在实践中对所学理论进行验证、对数据和软件的使用加以熟悉[9]。但生物信息学涉及专业领域内容广泛，学生不可能做到完全亲身实践，因此，案例教学法能替代亲身实践，吸取前人经验，是理论联系实践的一个便捷通道，是培养学生解决实际问题能力的好方法[7]。
4.案例教学法在生物信息学本科教学中的应用
4.1 案例选择
笔者针对生物信息学本科的教学大纲和知识体系，以及多年从事昆虫线粒体基因组分析的科研工作情况，精心选择了一系列分析案例，其中以鳞翅目灰蝶科线粒体基因组[10]数据分析为例说明。
4.2 教学过程
4.2.1学生分组。根据学生专业、兴趣分组，每组6人，统一采用同一案例。
4.2.2案例背景介绍。让学生了解该论文的目的、操作过程及意义。学生查找相关文献资料，归纳总结知识背景。
4.2.3案例分解。将整个案例分为若干个子案例：①序列数据来源；②序列比对分析③计算遗传距离；④分子系统发育重建；⑤蛋白质家族和基序与结构域分析；⑥蛋白质三级结构与结构分类分析。对每一个子案例完成的关键步骤提出问题，启发学生思考，鼓励学生对案例进行分析、讨论甚至辩论，提出解决方法，逐步完成案例。每个子案例的顺利完成都需要特定的生物信息知识作为基础，对应于教学大纲中完整的知识体系。
4.2.4评价考核。引导学生完成案例，教师归纳学生在整个案例教学过程中出现的普遍性问题并进一步讲解，对于个别小组在解决案例过程中展现出来的创造性解决方案进行分享学习。采用PPT成果展示、提交每一个子案例生物信息分析结果和解释报告，考查学生对案例设计的相关生物信息学理论知识和操作技能的掌握情况。
案例教学法作为一种具有启发性和实践性的教学方法，有效提高学生利用生物信息学工具获取相关知识解决生物学问题的学习兴趣和能力，增强教学效果。然而实践过程中还存在一些问题，例如：如何选择合适的案例既能激发学生的学习兴趣又反映生物信息学教学大纲的知识体系内容、如何有效把握课堂讨论的节奏和方向及与其他教学方法的融合，在今后教学工作中还需要不断改进教学方法，优化教学模式，丰富教学案例库，在实践中不断探索案例教学法在生物信息学本科教学中的适用性和有效性。
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生物信息学主要由基因组学、蛋白质组学、系统生物学、比较基因组学、计算生物学等学科构成，主要涉及的内容有生物数据的收集、存档、显示和分析，体外预测、模拟基因及蛋白质的结构和功能，对生物的遗传基因图谱进行分析处理，对大量的核苷酸和氨基酸序列进行比对分析，确定进化地位等。从生物信息学的概念及其涉及的内容中可以明确生物信息学不是一门独立的学科，所以要求教师在教学过程中掌握多领域的知识和技能，才能较好地把握该课程。
1．高等数学和统计学基础
生物信息学将数学和统计学作为主要的计算理论基础，主要包括数学建模、统计方法、动态规划方法、数据挖掘等方面。此外还包括隐马尔科夫链模型(HMM)在序列识别上的应用，蛋白质空间结构预测的最优理论，DNA超螺旋结构的拓扑学，遗传密码和DNA序列的对称性方面的群论等。因此，在生物信息学教学过程中要求教师具备数学及统计学的计算方法的基础知识，能够利用牛顿迭代法、线性方程回归分析、矩阵求拟、最小二乘法等进行数学建模和计算，从而对基因和蛋白质序列进行比对、进化分析和绘制遗传图谱等。
2．生物科学基础
生物信息学包含的生物类学科有，生物化学、分子生物学、遗传学等基础学科，基因工程、蛋白工程、生物技术等应用学科。根据其课程特点，学生在学习生物信息学课程前需要学习生物化学、分子生物学、遗传学、基因组学、蛋白质组学等基本生物学课程，对于基因序列、蛋白质序列、启动子、非编码区等概念有深刻的理解，同时需要对一些重要的生物学数据库有一定的了解，如美国基因数据库(GeneBank)、欧洲分子生物学实验室数据库(Embl)和日本核酸数据库(DDBJ)等。此外，要求学生能够利用生物学数据库查找基因序列、蛋白质序列、基因及蛋白质结构模型，能够读懂数据库中基因和蛋白质的信息注释，能够计算蛋白质序列的分子量和等电点，能够为扩增特定的基因片段设计引物，能够对特定物种进行系统发育分析等。
3．计算机科学基础
计算机是生物信息学的主要辅助工具，利用生物信息学研究生物系统的过程需要能够熟练使用计算机对大量的生物信息数据进行处理和分析，这主要包括对数据信息进行搜索(收集和筛选)、处理(编辑、整理、管理和显示)及利用(计算、模拟)。所以，学生在学习生物信息学的过程中需要了解和掌握一些常用的生物信息学软件，如BLAST和FASTA序列比对分析软件，Oligo和Primer引物设计软件，VectorNTI、DNASTAR、DNASIS等综合分析软件。此外，学生还需要学习和掌握一些常用的计算机语言，如正则表达式、Unixshell脚本语言和Perl语言。利用生物信息学在处理和分析海量生物数据的过程中，计算机软硬件资源需要配合处理分析软件的运行，因此要求计算机操作系统使用Unix和Linux操作系统，这些操作系统需要大量的操作命令进行输入执行过程，对于经常使用Windows操作系统的学生来说是一个较难跨越的障碍。
二、生物信息学课程教学中存在的问题
目前国内大多数高校的生物信息学教学采用传统的教学模式，即以课堂式的理论教学为主，缺乏必要的实践教学。理论教学模式固定、教学方法单一、教学内容狭窄，通常是介绍性、科普性的课程，甚至作为公选课程。少数高校开展生物信息学的实践课程教学，但多以验证性实验为主，缺乏和专业相适应的综合性、设计性实验，而开放性实验更无从谈起。
1．教学模式固定单一
生物信息学在内容层面涵盖诸多学科领域，注重应用性和实践性。然而，目前大部分高校把生物信息学作为一门孤立的课程，这导致教师需要将大多数课程内容压缩到一门课程进行教学，在有限的教学时数下灌输大量内容，增加了学生学习的难度，降低了教学质量。再者，大多数高校仅开展生物信息学的理论教学，忽视实践教学过程，造成生物信息学理论与实践内容的脱节，使学生在学习完理论知识后难以深入理解和吸收，无法将所学的知识应用到后续的工作和学习中，最终未能体现出该门课程的价值。
2．教师专业背景薄弱
作为一门交叉学科，生物信息学的教学要求教师具有较强的数学、生物学和计算机科学背景。然而，目前从事生物信息学教学的教师即便具备深厚的生物学背景，但是多数教师在数学和计算机方面较为薄弱，并不具备完整的生物信息学知识体系，对生物信息学发展趋势也了解不多。在师资缺乏的情况下，院系开设生物信息学课程，教师为了完成教学任务，仅仅在教学中进行介绍性的讲解，在课程考查方式上通过小论文、综述和课外活动等方式完成该课程的学习。因此，无论是理论教学还是实践教学均无法实现该课程大纲的要求，从而影响学生对生物信息学课程的理解和掌握，生物信息学的实践操作能力更无从谈起。
3．实践教学薄弱，专业教材缺乏
生物信息学实践课需要学生在网络环境下用计算机学习NCBI数据库的检索与使用、序列比对分析软件的应用、蛋白质空间结构图视软件的应用、序列拼接软件的应用等。但是目前，大多数高校开设的生物信息学课程多以理论教学为主，实践教学课时非常少或者为零，学生对于生物信息学课程的学习仅仅通过教材上抽象的文字描述进行理解和掌握，这导致学生在理论课中学到的知识无法在实践课中进行验证或操作，严重影响了生物信息学的教学质量，也偏离了教学大纲中强调的重在培养学生实践操作能力的培养目标。另外，目前还没有适用于生物科学专业的生物信息学教材。国内各大高校使用的教材多为国外教材的影印版或者中文翻译版本，这些教材偏重介绍生物信息学的理论和方法，涉及的实践内容较少，学生需要具有较高的相关知识才能接受和使用这些教材。因此，部分高校在生物信息学教学过程中往往使用自家编写的简化教材，从而造成生物信息学教学内容不统一，教学大纲混乱等情况。
4．实践课程经费不足，实践教学环境落后
当今，许多发达国家都很重视生物信息学的教学和研究，积极开展各种生物信息资源的收集和分析工作，培养大量生物信息学人才，为整个生物学的理论研究及其相关产业创新(主要是医药和农业)提供指导和支撑。国内对生物信息学的关注和认识起步较晚，其发展落后于国际发达国家。国家和高校对生物信息学的教学和科研资金投入力度不大，缺乏必要的仪器设备，生物信息学的实践教学条件得不到保障，比如大多数高校的生物科学专业没有相应的计算机实训室，配套软件也相对匮乏，落后于国际发展水平。
三、生物信息学教学模式改革的探索
1．修改理论和实践教学大纲，编写适用的实践教材
根据当今生物信息学的发展方向，制定和修改理论教学大纲，除了引物设计、基因和蛋白质序列比对、基因和蛋白质结构功能预测等基本内容外，还需添加系统进化树分析、聚类分析、蛋白质互作网络谱图等较为综合的内容。另外，增加实践教学课程比例，充实实践教学内容，结合理论教学内容增加综合性、设计性实验，适当提供科研环境，鼓励开展开放性实验。目前国内并没有系统的、专业的生物信息学实践教材，因此针对高校生物科学专业方向的特点，联合多学科领域(数学、生物科学、计算机科学)编写相应的生物信息学实践教材，在制定、修改实践教学大纲和编写教材的过程中结合学生的接受能力，由浅入深，多设实例和相关练习，使学生循序渐进的理解和掌握生物信息学的原理和方法，掌握更多的生物信息学工具。
2．紧密联系科研、基于实践问题开展教学
通过实践教学把生物信息学教学与科研有机结合起来，能够促进教学与科研的共同发展。在紧密联系科研的过程中，采用基于问题的教学(PBL)方法，通过实践教学环节，培养和训练学生把所学的生物信息学的知识和方法应用于各种生物科学领域的科研活动中，通过解决实际问题训练学生的实践技能，从而促进教学与科研的双重发展。例如，在生物信息学实践教学中多加入生产和科研中遇到的经典实例，鼓励学生利用相关的生物信息学软件及相关的理论和方法解决问题。学生也可以选择自己感兴趣的课题，利用自己熟悉的、合适的生物信息学软件和相关知识开展课题研究。此外，专业教师在指导学生课题研究的过程中还可以发现理论和实践教学的不足，不断的完善生物信息学理论和实践课程大纲和内容，提高教学质量。
3．开展多学科实践结合的教学模式
生物信息学属交叉学科，包含了不同领域的专业知识和技能，为使生物信息学教学达到教学的目标，该课程教学需要采用多学科实践结合的教学模式。多学科实践结合的教学模式是指联合不同领域、不同学科、不同专业的课程在教学的过程中结合生物信息学涉及到的知识和技能进行基础性、铺垫性教学。比如，在高等数学和统计学的教学过程中，针对生物信息学的需求，适当增加数学建模、统计方法、动态规划方法、数据挖掘等方面的基础内容，同时，开设实例实践教学，使学生理解和掌握隐马尔科夫链模型，牛顿迭代法、最小二乘法等方法的应用原理和规则;在生物科学专业课程设置上，尤其是实践课程的教学过程中，结合生物信息学涉及的引物设计、序列比对分析、基因及蛋白质结构功能预测等方面开展相应的设计性、综合性、开放性实验项目，使学生了解和掌握基本的生物信息学原理及软件的应用;在计算机科学的教学过程中，应根据生物信息学的需求，开设正则表达式、Perl语言、R语言等课程学习，以及增加Linux和Unix操作系统课程学习，使学生在学习生物信息学前打好坚实的基础。值得注意的是，生物信息学课程与其他课程的开设时间和顺序需要有一定的探索和评估，对于开设该课程的时间把握是开展多学科实践结合的教学模式的关键因素。过早开设生物信息学则会导致学生在不具备相应学科基础的条件下跨越式的接触生物信息学，无法理解和掌握相关的知识和技能;过晚开设则会使学生学习了相关学科知识和技能后，由于课程衔接不紧，导致在学习生物信息学时出现理解滞后和无法适应的现象。因此，针对不同专业和学科的特点，根据具体情况进行统筹安排，使生物信息学和其他相关学科课程有很好的衔接和过渡，以确保和提高生物信息学的教学质量。
四、结语
